口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD,并制备兔抗β6LBD多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体,构建的pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA方法测定抗体效价,并以Western blot鉴定其特异性。结果:SDS-PAGE电泳分析显示pGEX-4T-1-β6LBD诱导后表达一Mr约为42000的GST-β6LBD融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,用纯化GST-β6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性。结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白β6LBD多克隆抗体,为深入研究整联蛋白β6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础。

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体的制备

以纯化的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域重组蛋白为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体(McAb);采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,并用SDS-PAGE、间接ELISA以及间接免疫荧光法对制备的McAb的特异性进行鉴定。结果显示,成功获得5株能稳定传代并分泌抗β6亚基配体结合域的杂交瘤细胞株,分别命名为C4C7、E7C7、B8C9、C2D8和B7B6,其分泌的McAb为IgG2b(C2D8)和IgG2a(C4C7、E7C7、B8C9、B7B6)亚类。制备的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域McAb可为深入研究整联蛋白αvβ6在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。

口蹄疫病毒受体羊源整联蛋白β6亚基配体结合域的原核表达、纯化及鉴定

利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白。以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pPROEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRO/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物。成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊FMDV受体整联蛋白亚基β6LBD在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为33 kDa,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。用本试验室保存的抗FMDV受体猪源整联蛋白β6亚基LBD的单克隆抗体进行ELISA和Western blot检测,显示该单抗可与重组目的蛋白发生特异性反应,证明纯化后的蛋白与特异性抗体具有良好的特异性反应及抗原活性。为深入研究整联蛋白受体β6亚基在羊体内的分布及其在FMDV致病过程中的作用机制奠定了基础。