胎儿间充质干细胞cDNA扣除文库的构建

为了获得胎儿和成人间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSC)的差异表达基因 ,尤其是在胎儿MSC中特异表达的基因 ,应用抑制扣除杂交技术构建了胎儿和成人MSCcDNA扣除文库。首先 ,分别从胎儿和成人MSC中提取总RNA ,按照SMARTPCR方法依次合成单链和双链cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,胎儿MSCcDNA分别与两种不同的接头连接 ,再与成人MSCcDNA经过两次扣除杂交及两轮抑制性PCR扩增后 ,将产物与T载体连接构建成cDNA扣除文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增。结果 :文库扩增后共获得 890个克隆 ,对所获得的克隆进行PCR扩增鉴定 ,获得 76 8个阳性克隆 ,阳性率为 86 .3%。插入片段大小分布在 0 .2 - 1kb ,平均为 4 0 0 - 6 0 0bp。结论 :抑制扣除杂交技术是一种简便、有效的筛选差异表达基因的方法。胎儿MSCcDNA扣除文库的构建为进一步筛选、克隆胎儿MSC中特异性表达的功能相关基因奠定了基础。

应用抑制性消减杂交技术筛选三氧化二砷对肝细胞调节的差异表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建As2O3处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆As2O3调节相关基因,阐明As2O3对肝细胞调节作用的分子生物学机制. 方法:以As2O3处理HepG2细胞,同时以PBS处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌J109进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建三As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到109个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000bp插入片段.挑取含有插入片段的36个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得15种已知基因序列和6个未知功能的新基因. 结论:应用SSH技术成功构建了As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆前-X反式激活相关基因,了解该段基因的可能生物学功能. 方法:构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X,转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.cDNA经RsaI 酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆,进行茵落PCR 分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列. 结论:应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.

基于PCR的SSR标记分离方法综述

SSR分子标记是目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。SSR标记具有物种特异性,要应用该方法需要提前开发相应物种的特异SSR标记,而获得微卫星标记的经典方法是通过构建基因组片段文库和特殊标记SSR探针杂交法获取,这些方法经济成本相对较高且耗时耗力。近年来,该领域的研究中积累了很多研究成果和技术改进,发展起来几种基于PCR简便易操作且节约成本的SSR标记分离方法,例如基于RAPD的微卫星分离方法、基于ISSR抑制PCR扩增法、序列标签微卫星分析法、选择性扩增微卫星分析法以及荧光ISSR-PCR分离微卫星和微卫星扩增文库法等。本文主要对这些方法逐一进行综述,旨在为各个物种SSR标记的开发提供参考。