抗黑胫病烟草品种K326 cDNA文库的构建

以优质高抗黑胫病的烟草品种K326为材料,在苗期接种黑胫病菌丝,3 d后取叶片用Trizol试剂提取总RNA,经电泳检测28S,18S条带清晰,无DNA污染.以总RNA为模板,采用SMART技术合成双链cDNA,其产物主要集中在0.5～3kb之间,最大片段超过3kb.合成的双链cDNA经Sfi Ⅰ(A/B)酶酶切后,用CHROMASPIN-400层析柱分离分级cDNA,将大于0.5kb的cDNA片段混合,载入λTriplEx2载体,构建成云南第一个烟草cDNA文库.该文库的大小为1.2×107pfu.扩增文库的滴度达到1.2×109 pfu/mL.文库的重组率大于94%.取阳性克隆转化为质粒,通过PCR反应检测,重组体确有DNA插入,其片断大小在0.5～1kb之间.