文心兰侧花瓣转录组分析与调控唇瓣化变异相关转录因子的挖掘

文心兰因其独特的花型和艳丽的颜色是市场上重要的鲜切花。文心兰花瓣极易产生花型多样性,为了探究调控文心兰侧花瓣唇瓣化的分子机制,对柠檬绿文心兰(Oncidium flexuosum ‘Honey Angel’)及其侧花瓣唇瓣化变异种(突变体)的侧花瓣进行RNA提取和转录组分析。测序结果共获得45 525 415个高质量reads,鉴定出52 253个unigenes。利用NR、Swissprot、PFAM、GO、NT、KO、KOG七大数据库分别进行基因功能注释,分别注释到31 828、23 174、21 369、21 367、20 830、10 523、6465条unigenes。经表达量比较,在柠檬绿文心兰和突变体之间获得差异表达基因3120条。GO功能富集分析显示,共有1537条差异表达基因注释到生物过程、细胞组分和分子功能3个功能群组。KEGG功能富集分析显示,将690个差异表达基因富集到不同的代谢通路,其中代谢途径富集的基因最多。兰花唇瓣器官发育的研究更多地集中在MADS-box基因家族中,在该转录组数据中不仅筛选到5个显著差异表达MADS-box基因家族成员,还挖掘到其他可能与文心兰唇瓣发育相关的NAC、TCP、MYB及WRKY等转录因子。运用RT-qPCR对这些转录因子基因进行表达量验证,定量结果与RNA-seq数据一致,且这些转录因子大部分在文心兰唇瓣化侧花瓣中具有高表达,说明其可能正向调控着文心兰唇瓣器官的发育。综上所述,本研究挖掘到大量参与文心兰唇瓣化变异的关键转录因子,为兰花唇瓣发育分子机制及调控网络研究提供参考依据。

开满满的文心兰,肥嘟嘟的假鳞茎

文心兰,兰科文心兰属以及近缘种的统称,原产美国、墨西哥、圭亚那和秘鲁,它的拉丁语名称是从希腊语演变而来的,意思是“繁多”,充分说明了文心兰优秀的开花性,盛花之时,灿若繁星(图1)。花梗纤细柔软,遇风吹则颤动摇曳,极富动感,有很强的观赏性。

文心兰花粉离体萌发培养基的筛选及萌发率的测定

【目的】研究不同培养基组分、培养温度及培养时间对文心兰花粉离体萌发的影响,以期筛选出文心兰花粉离体萌发的适宜培养基及培养条件,为文心兰种质资源创新利用提供科学依据。【方法】以盛花期当天开放的花朵为试验材料,采用液体培养基,比较蔗糖、H_(3)BO_(3)、Ca(NO_(3))·4H_(2)O、MgSO_(4)·7H_(2)O及KNO_(3)对文心兰花粉离体萌发的影响,正交试验筛选文心兰花粉离体萌发培养基的最佳组合及培养条件;在此基础上,测定收集保存的68份文心兰种质资源的花粉离体萌发率。【结果】一定质量浓度的蔗糖、H_(3)BO_(3)、Ca(NO_(3))·4H_(2)O、MgSO_(4)·7H_(2)O及KNO_(3)对文心兰花粉的离体萌发具有一定的促进作用,各因素的最佳作用效果从高到低依次为H_(3)BO_(3)、Ca(NO_(3))·4H_(2)O、蔗糖、MgSO_(4)·7H_(2)O及KNO_(3)。正交试验表明适宜的液体培养基组合为100 g·L^(-1)蔗糖+10 mg·L^(-1)H_(3)BO_(3)+50 mg·L^(-1)Ca(NO_(3))·4H_(2)O+20 mg·L^(-1)MgSO_(4)·7H_(2)O+30 mg·L^(-1)KNO_(3),各成分的质量浓度与单因素试验的结果一致;培养条件为25℃、黑暗培养48 h。文心兰花粉离体萌发测定结果表明,60.29%的种质资源的花粉能离体萌发,萌发率普遍较低,为0.74%~49.65%。【结论】筛选出文心兰花粉离体萌发适宜的液体培养基组合及培养条件,不同文心兰种质资源的花粉离体萌发率存在明显差异,本研究结果可为后续文心兰种质资源的创新利用及他人研究等提供参考。

文心兰miR168分子进化特性及其对软腐病侵染的响应模式

【目的】探究文心兰miR168的分子进化特性,揭示文心兰miR168a及其候选靶基因响应软腐病菌侵染的表达模式。【方法】以文心兰miRNA文库、转录组数据库及miRbase数据库获取的植物miR168前体和成熟体序列为研究对象,利用生物信息学方法对其进行系统进化树构建、保守性分析、前体二级结构分析及靶基因预测;通过PCR技术克隆文心兰miR168a前体,采用qRT-PCR技术分析miR168a及其候选靶基因在文心兰不同组织(根、叶、假鳞茎)和感染软腐病(0,12,24,36和48 h)不同时间的表达模式。【结果】植物miR168序列保守性较高,来源于miR168前体的5p臂保守性高于3p臂,miR168前体分歧较大,茎序列的保守性高于环序列;从文心兰中克隆得到93 bp miR168a前体序列,包含21 nt miR168a成熟体序列。进化分析表明,物种亲缘关系对其前体和成熟体序列的形成影响较小;二级结构显示,文心兰miR168a前体能形成典型的发卡结构,其成熟体位于前体的5p臂;随着软腐病侵染时间延长,文心兰miR168a与其候选靶标RNA剪切复合体核心蛋白(AGO1)、RPM1互作蛋白(RIN4)、羧酸酯酶(CXE8)的表达趋势基本呈负相关,而与其候选靶标RNA解旋酶(PRH47A)、泛素羧基末端水解酶(UCH)的表达趋势呈正相关,说明可能存在其他miR168家族成员或miRNAs同时调控。【结论】文心兰miR168与其他植物miR168进化上兼具保守性和特异性,miR168a上调表达可能会增强文心兰的抗病性。

文心兰组培苗繁育技术规程

为了规范文心兰组培苗的生产、保证种苗质量,从组培苗繁育中的母株选择、外植体选取、外植体消毒、诱导培养、增殖培养、分化培养、生根培养、炼苗、试管苗质量,组培苗移栽中的环境条件、洗苗与消毒、基质、移栽、栽培管理、移栽苗质量等方面,总结出文心兰组培苗繁育技术规程,为文心兰组培苗标准化生产提供依据。

‘七彩湖’文心兰大规模栽培管理技术

‘七彩湖’是文心兰的1个杂交新品种,观赏价值高、受市场青睐,但未见大规模商业化栽培技术的报道。从‘七彩湖’文心兰组培苗移植、小苗管理、中大苗管理等阶段对其大规模栽培管理技术进行论述,为文心兰种植者提供参考。

文心兰试管苗丛生芽高效增殖体系的建立

分别采用细胞分裂素 6 - BA和 Ad对文心兰试管苗增殖的作用进行研究 ,结果表明 :在与 0 .2 m g/ L的NAA配合使用时 ,6 - BA含量在 2 .0～ 4 .0 m g/ L水平下的培养基较适合试管苗的增殖 ,最大增殖系数可达 7.2 7,苗生长健壮 ,叶色鲜绿 ,适合进一步生根移栽 ;Ad在 1.0～ 6 .0 m g/ L的范围内增殖系数较小 ,苗生长缓慢、矮小 ,但有形成丛生苗的倾向 ;以 2 .0 mg/ L 的 6 - BA和 1.0 m g/ L 的 Ad组合使用 ,易形成丛生芽苗且苗体相对较小 ,增殖系数也较高 ;接种单株小苗较大苗易形成丛生芽苗 ;接种连体小芽苗 ,全部能形成丛生芽苗 ,增殖系数可达 10 .0 7,适合于进一步增殖使用 .6 - BA与 Ad配合使用结合接种连体小芽苗可建立高效的丛生芽苗增殖体系 ,培养基最佳激素组合为 MS+6 - BA2 .0 m g/ L+Ad1.0 m g/ L+NAA0 .2 m g/ L+3%蔗糖 +0 .4 %琼脂粉 .

基本培养基及凝固剂对文心兰试管苗生长发育的影响

以薄叶系文心兰Alha‘lwanaga’茎尖诱导形成的原球茎 (Protocomlikebody ,以下简称PLB)进一步分化形成的幼苗为试材 ,比较不同培养基类型 (MS ,1/ 2MS ,VW )及不同种类凝固剂 (琼脂、Gellangum)对幼苗生长的影响 .结果表明 :实验用基本培养基类型中 ,幼苗的生长以MS较好 ,Gellangum作凝固剂时优于琼脂 .同时证明 ,培养时幼苗愈小 ,其基部PLB形成率愈高 .幼苗分化形成后 ,进一步培养以株高

碳源和有机添加物对文心兰原球茎增殖的影响

以薄叶系文心兰Oncidiumaloha'Iwanaga'茎尖诱导形成的原球茎(PLB)为外植体,采用树脂膜培养容器(CP)的液体静置培养方式,比较不同碳源(蔗糖、麦芽糖、山梨醇)和不同有机添加物(蛋白胨、胰蛋白胨、苹果汁、番茄汁、椰子汁)对文心兰PLB增殖的影响.结果表明,以蔗糖为碳源时,PLB在鲜重和干物重方面显著高于麦芽糖和山梨醇处理,同时PLB分化幼苗数较少;不同有机添加物处理,蛋白胨对PLB增殖效果显著,其次分别为蕃茄汁>椰子汁>苹果汁>蛋白胨.在幼苗分化方面,胰蛋白胨、苹果汁和椰子汁处理中,幼苗分化数显著高于蛋白胨和番茄汁处理,并在处理间存在显著性差异.蛋白胨和番茄汁两处理间在鲜重、干物重和幼苗分化数方面无显著性差异.

文心兰组织培养的研究

以文心兰不同发育时期的花蕾为外植体,研究了影响丛芽诱导、增殖、生根壮苗的主要因素。结果表明,处于原芽期的花蕾是诱导丛芽的较好材料;适合花原芽诱导丛芽的培养基是MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3％蔗糖,适合丛芽增殖成苗的培养基是MS+6-BA 2.0-4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3％蔗糖,适合生根壮苗的培养基为1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+2％蔗糖。

不同基本培养基及培养方式对文心兰原球茎增殖的影响

以薄叶系文心兰Alha′Iwanaga′茎尖诱导形成的原球茎 (PLB)为材料 ,比较不同基本培养基类型 (MS、1/ 2MS、VW )及不同培养方式 (固体培养、液体培养 )对原球茎增殖的影响 ,结果表明 :文心兰PLB增殖以 1/ 2MS为基本培养基配合振荡及回旋培养方式较好 ,固体培养方式因其幼苗形成率高 。

文心兰多倍体诱导及其鉴定

以类原球茎薄切片为外植体,用秋水仙素对离体薄切片再生类原球茎过程进行多倍体诱导,建立文心兰多倍体离体化学诱变技术体系。探讨了不同浓度的秋水仙素在不同诱变时间内对离体薄切片类原球茎形成及苗再生的诱变效应,比较了二倍体和多倍体试管苗的形态特征、叶片下表皮组织细胞结构特征,并对多倍体根尖细胞染色体数进行了鉴定。结果表明,秋水仙素对文心兰离体薄切片类原球茎的形成及其再生苗产生较大影响,较高浓度的秋水仙素处理较长时间时,形成类原球茎的薄切片比率及再生苗数减少明显,但多倍体形成的比率相对较高;多倍体苗叶片厚实、紧凑、植株较矮;叶片下表皮组织细胞、气孔结构与二倍体存在一定差异,细胞核明显较大,染色体加倍成功。

高分子树脂膜培养容器在文心兰试管苗培养中的应用

以低成本、高品质试管种苗培养和规模化生产为目的 ,采用具有高透气性、低透湿性、耐高温和易于成型加工的四碳氟乙烯树脂膜为材料制作新型培养容器 (CP) ,以文心兰‘AlohaIwanaga’为实验植物材料 ,在常规培养条件下探讨了树脂膜培养容器在文心兰试管苗生产中的有效性 .与传统培养容器三角瓶相比较 ,CP内生长的试管苗在株高、叶长、叶幅、根数、根长、鲜重、干物重、干物率和叶绿素指数等生长指标上高于常规培养容器 (三角瓶 ) .采用SSR法进行比较 (显著水平P≤ 0 0 5 ) ,其中在株高、叶长、叶幅、鲜重、干物重等重要生长指标之间存在显著性差异 .实验结果表明 。

甘露醇和生长抑制剂对文心兰离体保存的影响

以文心兰无菌苗为离体保存材料,研究培养基中添加不同浓度甘露醇、矮壮素及脱落酸对文心兰试管苗离体保存的影响。结果表明:在培养温度(24±3)℃,保存前6个月光照强度2 000～2 500 lx,后6个月光照强度500～1 000 lx,光照时间12 h.d-1的培养条件下,MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg.L-1+蔗糖30 g·L-1培养基中添加30 g·L-1甘露醇或30 mg·L-1矮壮素(CCC)或2.0 mg·L-1脱落酸(ABA)均能使文心兰试管苗连续保存12个月,从存活率、恢复生长与增殖情况及保存成本等综合考虑,其中以培养基中添加30 g·L-1甘露醇或30 mg·L-1矮壮素处理较适宜文心兰试管苗的保存,保存12个月的存活率达76.7%～80.0%;保存12个月的试管苗在增殖、生根培养基上均能正常恢复生长。

文心兰花粉活力与杂交结荚性研究

为分析文心兰花粉活力与杂交结荚性，以20个文心兰种质为材料，利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑对花粉活力进行测定，并配制杂交组合进行杂交授粉试验。结果表明：文心兰花朵开放当天其花粉活力最高，不同品种间花粉活力有差异，其中16个种质的花粉具有活力，活力变化范围为2．00％～72．33％；以花粉具有活力的品种作为父本，共配制杂交组合27个，其中14个组合获得发育成熟的果荚，结荚率变幅为8．33％～94．83％，文心兰种间杂交结荚组合比率为70．00％，高于属间杂交的41．18％。

干旱胁迫对文心兰抗氧化酶活性和渗透调节物质含量的影响

以切花文心兰"黄金2号"(Oncidium Gower Ramsey‘Gold 2’)幼苗及成熟苗为材料,用盆栽控制浇水模拟干旱的方法,对不同程度干旱胁迫下其叶片抗氧化酶活性和渗透调节物质含量的变化进行研究。结果表明,文心兰"黄金2号"具有一定的耐旱性。随着干旱胁迫程度的加深,文心兰幼苗及成熟苗的相对含水量和相对电导率变化慢、幅度小,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性能保持一定水平,渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸含量持续上升,表明文心兰"黄金2号"对干旱胁迫具有较强的适应能力。

文心兰黄化突变体的初步研究

对文心兰品种百万金币的10份体细胞无性系黄化突变体的叶绿素合成和叶绿体结构进行初步分析。结果表明：（1）黄绿条纹突变体（Y1～Y6）的总叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）含量显著降低，分别为正常植株的28．47％～87．21％和35．82％～91．98％；Y2、Y3、Y5和Y6的叶绿素a／b比值（Chla／b）显著升高，Y4的Chla／b显著降低；叶绿素合成分别在粪卟啉原Ⅲ（CoprogenⅢ）到原卟啉Ⅸ（ProtoIX）（Y1、Y2、Y3、Y5和Y6），及ProtoIX到镁原卟啉Ⅸ（Mg-ProtoⅨ）（Y4）的位点受阻。（2）完全黄化突变体（Y7～Y10）的Chl和Car含量显著降低，分别为正常植株的10．94％～15．22％和22．06％～28．94％；Chla／b显著升高，Chl／Car显著降低；叶绿素合成在CoprogenⅢ到ProtoⅨ的位点受阻。（3）黄叶组织内叶绿体和基粒片层减少；部分叶绿体异常，基粒片层稀疏松散或缺失，基质中含较多嗜饿颗粒和囊泡。（4）利用ISSR引物UBC827和UBC897在突变体中各检测出1个多态性位点。叶绿素合成受阻和叶绿体发育异常导致叶绿素含量减少是突变体叶片呈现黄色的主要原因。

高产优质文心兰新品种金辉的选育

【目的】选育产量高、品质优、抗逆性强的文心兰切花新品种,为优化福建文心兰品种结构提供候选品种。【方法】以主栽品种南西组培移栽苗为材料,利用植物体细胞无性系变异,于花期经田间优株初选、组培扩繁及株系比较试验后,再次优株复选、分子鉴定、组培扩繁和多点试验,选育文心兰切花新品种。【结果】选育出文心兰新品种金辉,该品种在福建种植时主花期为11月至翌年1月,次主花期为5～6月;盛花期时平均假鳞茎长、假鳞茎宽、花序梗长、花序长分别为10.96、4.11、40.14、78.14 cm,分枝数11.15个,分别比对照南西显著提高了21.64%、18.10%、18.58%、29.18%和22.66%;切花产量每667 m^2达3.07万支,比对照南西显著提高了17.18%;新芽生长位置明显低于对照南西,适应性好,抗逆性强,适宜福建冬季无霜冻及具相似气候条件的地区推广种植。【结论】利用植物体细胞无性系变异从南西组培移栽苗中筛选出了高产、优质、抗逆性强的文心兰切花新品种金辉,研究证实了植物体细胞无性系变异结合组织培养技术应用于切花文心兰新品种的选育是可行的。

文心兰茎尖组织培养的研究

文心兰茎尖离体培养研究表明 :文心兰茎尖在 MS+6 - BA 3mg/ L +Ad2 .5～ 3.5 mg/ L +NAA 0 .2 mg/ L培养基上培养 4 5 d后 ,茎尖分化出芽的同时也形成较多的原球茎 ;原球茎在 MS+6 - BA 2 .0 mg/ L +Ad 0 .5 mg/ L +NAA 0 .1mg/ L培养基上增殖速度最快 ,生物量增殖系数可达 8.8713;来自不同增殖培养基上增殖的原球茎在相同的分化培养基上培养时 ,接种后 15 d观察 ,不同来源的原球茎分化率不同 ,30 d后的分化率仍存在一定的差异 ;分化的文心兰幼苗在 1/ 2 MS+NAA 0 .2 mg/ L生根效果最好。

施CO_2时培养基糖浓度对文心兰试管苗生长的影响

探讨了培养室内施CO2条件下,培养基中不同蔗糖浓度(30、20、10、5、2.5和0 g·L-1)对文心兰试管苗生长的影响。结果表明:无糖培养基中的试管苗可以以光合自养的方式正常生长,但生长速度略低;提高培养基糖浓度可以显著促进试管苗的生长,30 g·L-1(常规培养条件的糖浓度)与20 g·L-1处理相比,株高、叶长、叶幅、根数、总鲜样质量和总干样质量等主要生长指标无明显差异,说明文心兰试管苗在施CO2培养时,培养基中的糖仍是必要的,但可以适当减少用量。