秦皇岛昌黎邻近海域青岛文昌鱼资源调查及大型底栖动物群落特征研究

为了解秦皇岛昌黎邻近海域国家二级保护动物青岛文昌鱼(Branchiostoma tsingdauense)的资源现状,科学评价该海域底栖环境生态健康状况,于2021年春、夏两季在昌黎邻近海域设置24个站位进行大型底栖动物及环境要素的调查监测,并使用香农威纳(Shannon Wiener)多样性指数及AZTI海洋生物指数(AMBI)、多变量AZTI海洋生物指数(M AMBI)对昌黎邻近海域大型底栖动物群落健康状况进行评价。调查结果表明:2021年夏季昌黎邻近海域青岛文昌鱼平均生物密度为5 ind./m^(2),处于近年调查的最低水平。春、夏两季昌黎邻近海域青岛文昌鱼均以Ⅲ龄鱼为主,种群年龄结构出现异常现象。春、夏两季共采集到大型底栖动物89种,两季大型底栖动物群落结构存在一定差异,物种更替率较高。两季大型底栖动物平均生物密度为138 ind./m^(2),平均生物量为20.95 g/m^(2),平均Shannon Wiener多样性指数为2.11。Shannon Wiener多样性指数及AMBI、M AMBI指数等生态健康评价方法评价结果相近,结果表明调查海域底栖生态系统受到一定程度的扰动,相较于春季,夏季受人为扰动程度更强。

热激活的Vg1转基因文昌鱼品系构建及表型分析

[目的] Vg1作为Nodal信号通路的重要配体之一参与了早期胚胎发育过程中的背腹分化调控及左右不对称模式的建立.构建Vg1转基因文昌鱼品系以研究其在文昌鱼胚胎不同发育阶段的功能.[方法]结合Tol2转座子转基因系统和热敏启动子Hsp70构建文昌鱼BbHsp70-BfVg1稳定转基因品系;并用热激实验、表型统计和原位杂交等手段对该转基因品系的有效性进行评估.[结果]热激结果显示,在囊胚晚期热激处理Vg1转基因文昌鱼导致胚胎背腹轴形成异常;在原肠胚中期热激处理Vg1转基因文昌鱼导致胚胎原本左右不对称的器官变为对称分布.基因表达分析结果显示,在囊胚晚期热激F1代胚胎中有部分比例胚胎的Vg1呈现全身性表达,背部中胚层标记基因Gsc表达扩张,腹部标记基因Evx表达下调,神经标记基因SoxB1a向腹侧蔓延;在原肠胚中期热激F1代胚胎中有部分比例胚胎的左侧特异基因Pitx呈现两侧对称表达,左侧口前窝标记基因Pit呈现两侧对称表达.[结论]初步构建了一个能够实现实时热激活Vg1的文昌鱼稳定转基因品系,并为后续在文昌鱼中进行基因功能研究提供了一个新手段.

厦门国家级珍稀海洋物种自然保护区文昌鱼(Branchiostoma belcheri)种群健康评价

利用2009—2010年四个季度月用底栖生物抓斗式采样器捕获的文昌鱼样品,从其资源分布、年龄结构、生物学和生态学特征等方面对厦门国家级珍稀海洋物种自然保护区文昌鱼的种群健康状况进行评价研究。结果表明:(1)文昌鱼种群资源分布衰减趋势明显,只在黄厝—前埔海区、小嶝岛—角屿海区和南线—十八线海区3个核心区还有分布,但资源密度低,分布范围狭小,而在鳄鱼屿实验区未能发现。(2)文昌鱼体重与体长之间关系:W=6.6895×104L3.1818;体长与体质量生长方程分别为:Lt=65.63[1e0.68(t+0.32)],Wt=404.62[1e0.68(t+0.32)]3.1818;夏季、冬季航次的优势体长组分别为25—35mm和35—45mm,优势体重组分别为25—50mg和50—100mg;秋季低龄鱼较多,而冬季高龄鱼比例较高。(3)采用ELEFANⅠ技术分析了厦门文昌鱼的Von Bertalanffy生长参数K、L∞、总死亡系数Z、自然死亡系数M和开发率E,发现其生长参数K值较大,自然死亡系数较高,开发率较大(0.69)。综之,厦门自然保护区内的文昌鱼种群健康状况整体不佳,应注意资源保护,加强保护文昌鱼栖息地的底质和水质以及防止过度捕捞以实现其资源可持续利用。

厦门文昌鱼(Branchiostoma belcheri Gray)种群杂合性研究

应用聚丙烯凝胶电泳技术,研究了厦门海域四个野生文昌鱼种群的杂合度缺乏和过量情况。在测定的7个酶系统中,共有14个等位酶基因位点,分别为Aat-1、Amy-1、Amy-2、Amy-3、Amy-4、Me-1、Me-2、Mdh-1、Mdh-2、Sod-1、Sod-2、Est-1、Est-2、Per-1。多态位点有8个,分别为Sod-1、Aat-1、Me-1、Me-2、Mdh-1、Mdh-2、Est-2、Amy-2。结果表明,在大嶝岛种群、南线至十八线东端种群、南线至十八线西端种群及黄厝种群中,多态位点Sod-1、Mdh-2、Me-2、Aat-1显著偏离H-W平衡标准(P<0.05),而位点Me-1、Mdh-1、Est-2符合H-W平衡标准(P>0.05)。多态位点Amy-2除南线至十八线东端种群显著偏离H-W平衡标准(P<0.05)外,其它三个种群的多态位点Amy-2均符合H-W平衡标准(P>0.05)。在所有的8个多态位点中,只有大嶝岛和黄厝两个种群的Amy-2位点表现为杂合子缺失(F>0),其它种群的多态位点均表现为杂合子过量(F<0)。造成杂合体缺失的主要原因可能是自然选择、近交、哑等位基因等。杂合体的缺失会导致某些基因从该物种的基因库中消失,从而降低了物种的遗传多样性,同时也使物种对环境的适应能力降低。

青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)染色体G类带型研究

以青岛文昌鱼的晚期囊胚和早期原肠胚的胚胎细胞为实验材料,利用低渗处理、空气干燥法制备染色体玻片标本。在此基础上,为进一步探索显示青岛文昌鱼染色体G带的新方法,采用片龄、蛋白酶K和胰蛋白酶显带技术对青岛文昌鱼的染色体进行了初步研究,显示了青岛文昌鱼染色体的G类带型,绘制了青岛文昌鱼染色体的G类带型模式图,并对三种G类带型作了比较,进而提出了文昌鱼染色体的G带带型与片龄的相互关系。

湛江海域文昌鱼(Branchiostoma)线粒体Cyt b基因的全序列分析

测定了邻近湛江的茂名海区和硇洲岛海域文昌鱼各2个样本线粒体Cytb基因全序列,以尾索动物亚门的2种海鞘(Ciona spp.)和脊椎动物亚门的七鳃鳗(Petromyzon marinus)作为外群,利用分子系统学方法与GenBank收录的14个文昌鱼(Branchiostoma)的Cytb基因全序列进行了比较,UPGMA法构建了系统发生树。全序列分析表明:主产于大西洋(批针文昌鱼B.lanceolatum和佛罗里达文昌鱼B.floridae)、厦门文昌鱼(B.belcheri belcheri Gray)和湛江文昌鱼线粒体Cytb基因全序列长度为1143bp,终止密码子同为UAG;主产于青岛文昌鱼(B.belcheri tsingtaunese)和日本文昌鱼为1141bp,以T结尾,转录过程中构成UAA终止密码子。系统分析表明:16个文昌鱼样品体现出太平洋和大西洋、太平洋南北明显分化。确认采自茂名和硇洲岛的文昌鱼为厦门文昌鱼(B.belcheribelcheriGray);支持将白氏文昌鱼青岛亚种(B.belcheri tsingtaunese)提升为种,命名为日本文昌鱼(B.japonicus)。

文昌鱼(Branchiostoma belcheri)离体细胞原代培养初步研究

分别以不同类型的培养液和盐度条件培养文昌鱼尾部、鳃、肝盲囊组织细胞.观察显示经培养文昌鱼三类组织块在贴壁后24 h内细胞开始从组织块内迁移出来,并迅速增殖形成细胞晕,鳃组织细胞为圆球形状,尾部组织细胞为多边形上皮样细胞,肝盲囊组织细胞为圆球形状.其中肝盲囊细胞和鳃组织细胞在含0.45%NaC l、15%小牛血清的Eagle’sMEM培养粉中生长较其他培养条件好,而尾部组织细胞则在含0.9%NaC l、15%小牛血清的Eagle’s MEM培养粉中生长较其他培养条件好.这样的细胞能存活近40天,从而为文昌鱼体外细胞培养及建细胞系提供了依据.

盐酸胍对文昌鱼Branchiostoma belcheri(Gray)酸性磷酸酯酶构象与活力的影响

本文报告了文昌鱼酸性磷酸酯酶在不同浓度的盐酸胍作用下酶的构象与催化活力变化的关系。盐酸胍浓度在1mol/dm^3时,酶活力提高50%.随着盐酸胍浓度提高(2～4mol/dm^3),酶活力下降,荧光强度也下降,荧光发射光谱λ_(max)值明显红移(330～358nm)。测其变性及失活动力学常数,结果表明,酶的失活速度大于变性速度,表现为慢构象变化、快活力变化的一种模式。在盐酸胍3～4mol/dm^3时,酶的变性与失活过程表现为两个一级反应过程(快相和慢相),其构象与催化活力的变化表明AC-Pase 与活力部位相关的色氨酸残基微环境产生了变化。

湛江硇洲岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri)的食性研究

于2006年4～7月在湛江硇洲岛海域采集文昌鱼，进行春夏季节不同性别、不同体长组等的胃含物观察分析。结果表明，湛江硇洲岛文昌鱼消化道残留食物成分以泥沙碎屑为主，可辨生物成分有34种，大部分为底栖硅藻，占58．8％，也有少量甲藻、瓣鳃类幼虫、底栖桡足类幼虫和原生动物等。春夏季节的文昌鱼的摄食喜好不尽相同，饵料生物的出现率随着季节的变化有所变化。不同性别文昌鱼的摄食喜好比较相近。文昌鱼到了性腺成熟后才开始进食动物性食物。研究结果表明，文昌鱼摄食藻类、微生物等而自身转化为其他动物的较高营养层次食物，在海洋食物网中具有一定的重要作用。

青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheritsingtauense)染色体荧光原位杂交条件研究

采用青岛文昌鱼18SrDNA序列为探针进行荧光原位杂交,根据囊胚晚期细胞上的核杂交信号多少及特异性确立青岛文昌鱼染色体荧光原位杂交的最佳反应条件。结果表明适合于青岛文昌鱼染色体荧光原位杂交的条件为:预处理采用5ng/μl的胃蛋白酶处理3—5min和10ng/μlRNA酶处理1h;100—300倍探针浓度的鲑鱼精DNA进行封闭;50%甲酰胺/2×SSC,1×SSC,2×SSC,42℃的洗脱强度;3%BSA进行抗体封闭;杂交时间可以控制在12—18h;杂交温度保持37℃;PI(1.5μg/ml)的量每片20μl以内。

白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)解剖结构名称的探讨

白氏文昌鱼一直以来在动物学教学中作为头索动物的代表动物被详细介绍,终生具有脊索动物的3个主要特征即脊索、背神经管和咽鳃裂,而且都表现得很典型。广泛使用的《普通动物学》教科书中图示的白氏文昌鱼的"背神经管"、"肝盲囊"的名称标注需要重新讨论,在教科书中它们分别被标注为"神经索"和"肝"。

促生长激素样免疫活性细胞和生长抑素受体在文昌鱼(Branchiostoma belcheri)神经系统和哈氏窝的分布

用免疫组织化学与双标记染色技术对文昌鱼神经系统和哈氏窝进行生长激素(GH)和生长抑素受体(SSTR)免疫组织化学定位．研究结果显示,神经系统和哈氏窝均存在生长激素样免疫活性神经细胞和内分泌细胞及生长抑素3种亚型受体,且脑泡GH样免疫活性神经细胞和哈氏窝GH 样细胞均与3种亚型生长抑素受体共存．这些结果证明了文昌鱼可能建立类似脊椎动物原始的抑制哈氏窝分泌生长激素的调控系统,为哈氏窝内分泌学及其进化提供了新的证据．

文昌鱼Gsc基因在早期胚胎发育中的功能

同源异型盒基因Goosecoid(Gsc)在脊椎动物胚胎“组织者”和脊索前板形成中具有重要功能.为探究该基因在脊索动物胚胎发育中的功能演化,通过基因过表达、原位杂交等手段对其在文昌鱼胚胎发育中的功能展开分析.结果显示:向文昌鱼胚胎中注射Gsc mRNA及其转录抑制形式EN-Gsc(HD)mRNA,均导致胚胎发育出现相似的体轴发育畸形,说明Gsc在文昌鱼胚胎发育中具有重要功能,且主要以抑制型转录因子形式发挥作用.基因表达分析显示,Gsc过表达导致原肠胚期中胚层发育相关基因Brachyury、Wnt8和背部标记基因Chordin、Lefty的表达量下降,腹部标记基因Vent表达范围向背部扩张;神经胚中期Brachyury在后端尾芽的中胚层祖细胞中表达量下降,体节标记基因m-actin标记的体节数减少,神经管和尾芽标记基因Wnt3在尾芽处的表达量下降而在神经管处表达范围变宽.以上结果表明,文昌鱼Gsc基因在胚胎早期发育过程中的体轴建立、中胚层形成及后期尾芽功能维持中均有重要功能.

昌黎海域青岛文昌鱼栖息地评价及其分布特征

利用2021年调查数据,对昌黎海域青岛文昌鱼栖息地环境及其分布特征开展综合研究。研究结果表明,保护区海域水质、沉积物质量状况良好。青岛文昌鱼主要分布在中砂至细砂类型的底质中,主要粒组为0.125~0.500 mm,平均栖息密度为70.4 ind./m2,平均生物量为4.71 g/m2,Ⅲ龄青岛文昌鱼占优势地位。青岛文昌鱼密度与COD和浮游植物密度呈显著相关(p<0.05),与浮游植物种类数呈极显著相关(p<0.01);生物量与COD、沉积物铅和浮游植物种类数呈显著相关(p<0.05)。

青岛文昌鱼zglp-1基因的进化与表达研究

为了在头索动物文昌鱼中对zglp-1(Zinc finger, GATA-like protein 1)基因进行鉴定,并检测其在青岛文昌鱼(Branchiostomajaponicum)中的组织定位,本文对文昌鱼zglp-1基因的进化及表达进行了研究。同线性分析表明,文昌鱼zglp-1基因是斑马鱼zglp-1和人ZGLP-1基因的同源基因。文昌鱼Zglp-1蛋白的锌指结构域在进化上保守性较高,其三维结构与脊椎动物Zglp-1蛋白的三维结构也高度相似。系统进化分析显示,文昌鱼Zglp-1处于脊椎动物Zglp-1进化的基部,可能代表了脊椎动物Zglp-1进化的原始形式。利用RACE技术克隆得到青岛文昌鱼zglp-1基因完整的ORF序列,其编码389个氨基酸。实时定量PCR技术显示zglp-1基因在文昌鱼性腺中特异高表达,其中在卵巢表达最高;再利用切片原位杂交技术发现zglp-1基因在卵巢、精巢、肝盲囊和鳃等组织中有阳性信号,其中在卵巢中信号最强,与实时定量PCR检测结果基本一致。综上,本研究表明文昌鱼zglp-1为脊椎动物Zglp-1的同源基因,其在文昌鱼性腺高表达,这与该基因在脊椎动物性腺中的表达模式相类似。

福建沿海文昌鱼的分布及其资源保护对策

采用现场采样方法对福建沿海文昌鱼(Branchiostoma balcheri)的分布和资源状况进行了调查,为文昌鱼的保护提供依据。全省19个海区潮间带均未捕获文昌鱼;12个海区的潮下带浅海定量调查中,仅5个海区采集到文昌鱼。东山湾海区文昌鱼密度最高,为41.67尾/m2,其次是厦门十八线海区,为14.5尾/m2,厦门南线海区和黄厝海区分别为5.39尾/m2和4.71尾/m2,泉州大港海区仅捕到1尾,闽江口3个海区均未捕获。所获文昌鱼年龄大多为1龄,占39.2%,2龄占23.5%,3龄占25.5%,其他(1龄以下、4龄、5龄及以上)占11.8%。与20多年前的历史资料相比,文昌鱼的分布区大为缩小,资源量大为降低,资源已濒临枯竭。必须加大对文昌鱼资源的保护力度,有必要增设文昌鱼自然保护区,并加强对文昌鱼保护区的管理。

青岛文昌鱼体征变化及影响因素探究

根据1981年和2004年胶州湾口青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense Tchang et Koo)采集资料,分析了23年来青岛文昌鱼体质量、体长、生物量和栖息密度的变化,发现1981年文昌鱼个体最大体长为55 mm,平均体长为37.63 mm,而2004年个体最大体长仅42 mm,平均体长只有29.82 mm;1981年各月平均体质量范围为0.06～0.14 g,2004年为0.03～0.04 g;1981年平均栖息密度为753个/m2,2004年为1 220个/m2。采用成对数据平均数比较的假设双尾检验法进行数据统计分析结果也表明,文昌鱼的平均体长和体质量在1981年和2004年均有显著的差异,平均分布密度在显著水平a为0.01时,差异不显著,而在a为0.05时,差异显著;说明2004年采集的青岛文昌鱼个体长度和质量都明显变小而分布密度有所增加;而平均生物量,1981年和2004年没有显著性差异。不同体长个体数比例表明,1981年和2004年文昌鱼种群的年龄组成以及各年龄组的生长情况等方面也不相同。引起这些变化的原因初步分析为底质的改变、栖息地萎缩、饵料丰度和组成改变以及人类活动的干扰。

文昌鱼鳃组织原代培养

采用组织块培养法培养文昌鱼（Branchiostoma belcheri japonicum）鳃细胞，使用L15，M199，Eargle’s MEM为基础培养基，加入一定量的NaCl及5％，10％，20％等不同体积分数的牛血清。经条件优化后得到最适合的培养条件为2L15＋20％FBS＋0．45％NaCl，在26～28℃条件下培养，组织决贴壁后12h内就有至少4类上皮样细胞从中迁移出来，这些细胞在前3天迅速增殖，到第6天基本上达到平稳期，往后细胞开始凋亡，最长可以存活近两个星期。鳃细胞的原代培养为文昌鱼细胞体外培养的深入研究提供了实验依据。

青岛文昌鱼遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD技术对青岛文昌鱼雌、雄各 11条个体共 2 2个样本进行遗传多样性检测。从 4 0个寡聚核苷酸随机引物中筛选出 17个扩增重复性好、条带清晰、特异性强的引物 ,对每个个体基因组DNA进行了扩增。得到RAPD产物的分子量在 2 0 0～ 2 2 0 0bp之间 ,产物总计 12 7个位点 ,其中 ,多态位点 6 0个 (占 4 7 2 4 % )。计算个体间遗传相似系数平均为 0 86 5 6 ,个体间遗传距离平均为0 1344。用Shannon多样性指数量化的遗传多态度 (H0 ) ,雄性群体 (0 1912 )高于雌性群体(0 112 5 ) ,平均遗传多态度 (Hpop)为 0 15 19。文昌鱼遗传多态度所占的比例在群体内为 0 2 5 5 3,而雌、雄群体间为 0 74 47。在文昌鱼雌、雄个体RAPD产物中 ,两个电泳图谱上能读出明显的雄性特征带 ,估计可能与雄性文昌鱼具有异型性染色体有关 ,这与XY型性别决定机制相吻合。引物OPC12扩增产物 2 5 0bp为雄性文昌鱼所特有 ,可能为区别性别的分子标记。用NJ法进行聚类分析 ,结果表明 ,2 2个个体明显按性别聚成两类 ,文昌鱼雌、雄个体基因组间的差异较大。

几种重金属对青岛文昌鱼毒性及生长的影响

对1991年8月在青岛崂山沙子口海区底层沙中拖网采集的体长为1．8—2．2cm的青岛文昌鱼，进行不同剂量的Cu2＋、Zn2＋、Cr6＋等重金属的毒性影响实验。结果表明，青岛文昌鱼对重金属反应敏感，重金属如超过一定浓度便可引起文昌鱼中毒乃至死亡，但微量的重金属则能促进文昌鱼的生长。