斑地锦查尔酮合酶基因及启动子的克隆与分析

黄酮类化合物槲皮素是斑地锦主要药效成分之一,而查尔酮合酶(CHS)是槲皮素生物合成过程中的关键酶。为阐明斑地锦中槲皮素生物合成机制,本研究以斑地锦为材料,根据转录组测序数据结合3'RACE、Tail-PCR技术,克隆了CHS基因及其启动子,将该基因命名为EmCHS(GenBank登录号为ON652865)。对EmCHS蛋白进行氨基酸序列比对、理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位和系统进化树等分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测EmCHS在不同生长期不同组织中的表达情况。结果显示,EmCHS开放阅读框(ORF)全长为1194 bp,编码397个氨基酸,EmCHS蛋白定位于细胞质,理论等电点为5.96,相对分子质量为43.48 kD,不含跨膜区域,为结构稳定的亲水性蛋白。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果显示,EmCHS与同为大戟科的木薯氨基酸序列相似性最高(91.92%),符合植物分类学的特点。RT-qPCR实验表明,EmCHS基因在斑地锦不同生长期不同组织中均有表达,且存在明显差异,在生殖生长期叶内表达水平最低,生殖生长期根内表达水平最高。克隆到的EmCHS启动子(GenBank登录号为OP626754),长度为971 bp,生物信息学分析结果显示,其既含TATA-box、CAAT-box等基本序列,也含有MYB、MYC等转录因子结合位点、多个光反应元件(G-box等)和激素反应元件(ABRE等)等顺式作用元件。实验结果为进一步研究斑地锦CHS基因功能及表达调控奠定基础。

斑地锦黄酮醇合成酶基因(EmFLS)及其启动子克隆及表达分析

【目的】克隆斑地锦黄酮醇合成酶基因(EmFLS)及其启动子序列,并检测EmFLS基因在斑地锦不同生长期不同组织中的表达模式,为后续研究该基因对黄酮醇化合物生物合成的调控机制提供理论参考。【方法】以斑地锦为材料,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术和热不对称交互式PCR(Tail-PCR)技术克隆EmFLS基因及启动子序列,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测其在不同生长期不同组织中的表达模式。【结果】扩增获得EmFLS基因开放阅读框(ORF)(GenBank登录号ON821211.1),长度为1002 bp,编码333个氨基酸残基,蛋白相对分子质量为37.62 kD,定位于细胞质,为不稳定的亲水性蛋白,属于2OG-Fe(II)加氧酶超家族。EmFLS蛋白与其他13种植物FLS蛋白的氨基酸序列相似性为63.55%~70.51%,其中与木薯FLS蛋白的氨基酸序列相似性最高,且在系统发育进化树上处于一个独立的分支。EmFLS基因启动子约1800 bp,除含有真核生物启动子核心元件TATA-box和CAAT-box外,还含激素响应、胁迫响应和光响应等顺式作用元件。EmFLS基因在营养生长期和生殖生长期的根、茎、叶和果中均有表达,但在根和茎中的相对表达量显著高于叶和果(P<0.05,下同),斑地锦从营养生长期到生殖生长期EmFLS基因在根和茎中的相对表达量显著下降,而在叶中无显著变化(P>0.05)。【结论】EmFLS基因表达具有组织特异性,且在根和茎中具有发育阶段特异性,推测EmFLS基因主要参与调控斑地锦根和茎中黄酮醇化合物的生物合成。

基于转录组测序的斑地锦内参基因筛选及验证

斑地锦(Euphorbia maculata)是一种常用中药材,其中黄酮类化合物槲皮素是其主要药效成分之一。目前斑地锦槲皮素生物合成基因研究鲜见报道,而实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是基因研究的常用方法之一,但具有合适的内参基因是RT-qPCR相对定量的前提条件。为了获得适合的斑地锦内参基因,本研究基于转录组测序结果,筛选出斑地锦EmSE、EmUBC、EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、EmSYP22、EmTRI1、EmRSZ21、EmRPL7以及课题组前期得到的EmUBQ共10个基因作为侯选内参基因。通过RT-qPCR检测10个候选内参基因在斑地锦营养生长期和生殖生长期的根、茎、叶及果中的表达情况,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析候选基因的表达稳定性,通过几何平均值法对不同软件所得结果进行整合并明确综合排名,即EmGDI1>EmUBQ>EmSE>EmUBC>EmLSM12=EmGBP>EmTRI1>EmSYP22> EmRSZ21=EmRPL7。以EmGDI1为内参基因,对槲皮素生物合成过程中的一个关键酶基因EmC4H进行表达分析,EmC4H在不同生长期不同组织内的表达差异与转录组测序结果趋势基本一致。本研究开发的内参基因EmGDI1可作为斑地锦不同生长期基因组织特异性表达研究中适合的内参基因。

入侵植物斑地锦浸提液对几种蔬菜的化感作用研究

为了深入理解斑地锦对入侵地作物的危害及其入侵机制,用蒸馏水浸提斑地锦茎叶内地有效成分,以番茄、辣椒、苋菜和荆芥为受体,利用培养皿滤纸法研究斑地锦浸提液对种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明,斑地锦浸提液可降低四种蔬菜种子的发芽速率,抑制番茄、辣椒和荆芥的发芽率,并且这种抑制作用随处理浓度的提高而加强,而对苋菜种子的发芽率无显著影响;0.4g/ml的斑地锦浸提液强烈抑制了四种蔬菜根的生长,却不同程度地促进了辣椒、荆芥和苋菜茎的生长,对根/茎比的影响与对种子发芽率的影响类似。

斑地锦与地锦总黄酮含量及抗氧化活性比较

以5月营养生长期、7月开花前期、9月果期的斑地锦与地锦为材料,比较它们的总黄酮含量及抗氧化活性的差别.结果表明,斑地锦的总黄酮含量均低于地锦;开花前期斑地锦总黄酮含量为20.28～22.23 mg/g,地锦的为34.67～37.50 mg/g;斑地锦提取液还原力明显弱于地锦,并与总黄酮含量呈正相关;两者在超氧阴离子和羟自由基清除能力上差别不大,斑地锦提取液含量为1 mg/g时,对超氧阴离子的清除率为54%,地锦的为56%;斑地锦提取液含量为10 mg/g时,对羟自由基的清除率为89%,地锦的为92%.

斑地锦总黄酮的提取及抑菌作用

研究了斑地锦总黄酮的提取工艺。结果表明:连续回流法明显优于浸渍法;正交实验得出总黄酮最佳提取条件为A1B3C3D3,即65%的乙醇12倍量提取4次,每次2 h条件下提取液中总黄酮含量最高;各因素对试验结果的影响顺序为D(提取次数)>B(提取时间)>C(加倍量)>A(乙醇浓度)。斑地锦总黄酮是主要的抑菌成分之一,其对温和气单胞菌的最低抑菌浓度为1.25 mg/mL,最小杀菌浓度为10 mg/mL。

外来入侵植物斑地锦生物学特性及危害特点研究

斑地锦原生长于北美洲,后归化于欧亚大陆,我国长江流域及江南等地均有发生。近年来又在湖南、陕西等地发现。斑地锦以种子繁殖,繁殖系数非常大。斑地锦入侵城市草坪后常形成单优群落,降低物种多样性,破坏景观的自然性和完整性。进入农田和果园后,将影响产量和品质。斑地锦全株有毒,能诱发人体细胞组织癌变。对斑地锦的防除可采取人工铲除、释放天敌、种植替代植物、喷洒除草剂等方法。

斑地锦和地锦的生长特征及其竞争能力比较研究

通过野外样方调查,比较了入侵种斑地锦和土著种地锦的生长特征和竞争能力.结果表明:斑地锦的有性繁殖效力显著高于地锦,其果穗数和果穗长明显大于地锦,而营养生长效力显著低于地锦,其叶面积则明显小于地锦,说明斑地锦较多地投资于繁殖生长,而地锦较多地投资于营养生长.种间竞争和种内竞争明显降低了入侵种斑地锦和土著种地锦的平均每株果穗数、果穗长、单株地上生物量和单株总生物量,且地锦的种间竞争能力(相对邻里效应指数)显著大于入侵种斑地锦,表明入侵植物斑地锦目前不能对广泛分布的地锦发生竞争取代.

斑地锦的化学成分

Nine compounds were isolated from the ethanol extracts of \%Euphorbia maculata \%L. By spectroscopic and chemical methods, their chemical structures were identified as: quercetin (Ⅰ), kaempferol (Ⅱ), apigenin\|7\|O\|glucoside (Ⅲ), luteolin\|7\|O\|glucoside (Ⅳ), quercetin\|3\|O\|arabinoside (Ⅴ), ethyl gallate (Ⅵ), ellagic acid (Ⅶ), scopoletin (Ⅷ) and umbelliferone (Ⅸ). Compounds Ⅲ～Ⅸ are found from this species for the first time.

斑地锦入侵对马铃薯实生苗生长和活性氧代谢的影响

试验以斑地锦苗数比LK99实生苗数等于0∶1为对照,设1/3∶1、1∶1、3∶1三个水平处理,研究斑地锦入侵情况下LK99实生苗生长和活性氧代谢特性。结果表明,LK99实生苗生长和活性氧代谢受入侵水平和入侵时间的协同影响。1/3∶1水平对LK99苗生长和活性氧代谢影响不明显;1∶1水平下LK99实生苗徒长,茎粗减小,SOD和CAT活性持续升高,O2-产率、H2O2含量、MDA含量、Pro含量先升高后下降;3∶1水平下,LK99实生苗生长减慢,SOD和CAT活性先升高后下降,O2-产率、H2O2含量、MDA含量、Pro含量持续升高;3个水平对根的伸长影响不明显。

入侵植物斑地锦的生物学特性及其对3种草坪植物的化感作用

采用室内生物测定法,以白三叶、高羊茅、早熟禾3种草坪植物为受体,研究不同质量浓度的斑地锦水浸提液对3种受体植物种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明:①浸提液均对3种受体植物幼苗的根长存在显著抑制作用,抑制作用随浸提液含量的升高而增强;浸提液对白三叶的抑制综合效应(SE)最强。②质量浓度为0.01和0.02 g.mL-1的浸提液对高羊茅和早熟禾的幼苗株高有促进作用,质量浓度为0.01 g.mL-1浸提液对白三叶和早熟禾的种子活力有促进作用,但促进作用不显著。化感物质定性试验显示,斑地锦水浸提液中含有酚类化感物质。

半湿润区斑地锦入侵后马铃薯的光合响应

试验以无斑地锦入侵条件为对照,研究半湿润区斑地锦入侵对马铃薯叶片光合色素含量、PSⅡ荧光特性和吸收光能分配的影响。结果表明,斑地锦入侵后,马铃薯叶片5-氨基乙酰丙酸、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、PSⅡ原初光能转化效率Fv/Fm、PSⅡ有效光化学量子产率Fv’/Fm’、光化学量子效率ΦPSⅡ、表观光合电子传递速率ETR、光化学荧光猝灭qP和光化学反应百分率Pc在各生育期都有不同程度降低,非光化学荧光猝灭NPQ和天然热耗散百分率Hd升高,非光化学耗散百分率Ex变化不大;斑地锦胁迫对马铃薯叶片叶绿素特性、PSⅡ叶绿素荧光活动和吸收光能分配的影响与马铃薯生育期有关,随生育期推后,影响加大,斑地锦胁迫并没有破坏PSⅡ荧光随生育期的变化规律。

斑地锦化学成分的研究

大戟科大戟属植物斑地锦(Euphorbia maculata L.)在山东等地民间与同属植物地锦(E.humifusa Willd)混用入药,治疗痢疾、跌打损伤和各种出血。斑地锦的化学成分除日本学者森因丽子等对其蜡质部分进行过研究外,很少见到报道。作者从该植物中分离到三个化合物,根据理化性质和光谱数据将它们分别鉴定为二十八烷醇(octacosanol)、并没食子酸(ellagic acid)和没食子酸(gallic acid),后二者是第一次从该植物中分离到。据报道,二十八烷醇为植物生长调节剂,并没食子酸与没食子酸均具有收敛止血之功效。

斑地锦降压作用的初步研究

目的:观察斑地锦对家兔实验性高血压的药理作用。方法:采用麻醉家兔颈总动脉插管法,按1ml/kg体重注射斑地锦水提液(10g/100ml),测定并比较给药后各组家兔血压的变化,考察其降压作用。结果:斑地锦水提液能明显降低家兔的收缩压和舒张压。结论:斑地锦水提液具有明显的降压作用,可为斑地锦资源的开发与利用提供依据。

基于UHPLC-Q-TOF-MS技术的斑地锦化学成分分析

目的:应用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱联用技术(UHPLC-Q-TOF-MS)对斑地锦中的化学成分进行定性分析。方法:采用Agilent Zorbax Extend C_(18)色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min;采用电喷雾离子源在正、负离子模式下采集数据。结果:根据化合物的精确分子质量和碎片离子信息,结合对照品比对和文献数据,从斑地锦中鉴定推断出35个化学成分。结论:应用UHPLC-Q-TOF-MS技术能够高效快速地鉴定斑地锦中的化学成分,为斑地锦的质量控制以及药效物质基础的阐明提供了科学依据。

广西斑地锦及其混淆品DNA条形码分子鉴定

为鉴定斑地锦(Euphorbia maculata L.)及其混淆品,以广西采集的41份斑地锦及其混淆品为研究对象,提取其基因组DNA,对各个样品的条形码rbcL和psbA-trnH序列进行扩增并测序,与GenBank下载的13份斑地锦及其混淆品rbcL和psbA-trnH序列进行了分析比对,计算了斑地锦及其混淆品的种内、种间遗传距离并采用邻接法构建了系统发育树。结果发现,斑地锦种内遗传距离明显小于其与混淆品的遗传距离,系统发育树中斑地锦样品聚为单系并能够与其混淆品明显区分开,这表明rbcL和psbAtrnH序列可用于斑地锦及其常见的混淆品的鉴别。

斑地锦黄烷酮-3-羟化酶基因及启动子的克隆与分析

该研究以斑地锦茎叶为材料,利用同源克隆结合RACE和Tail-PCR法,克隆了1个黄烷酮-3-羟化酶(F3H)基因,命名为EmF3H(GenBank登录号为MW767838),其ORF区为1092 bp,编码364个氨基酸。生物信息学分析显示,EmF3H蛋白相对分子质量为40.93 kD,等电点为5.47,属于2-酮戊二酸铁依赖的双加氧酶超家族,其氨基酸序列与油桐的序列相似性为85.5%,在系统进化上为相对独立的一个分支。采用Tail-PCR法获得1604 bp的EmF3H启动子序列,分析发现其内含TAAT-box、CAAT-box等序列和G-box等光反应元件。qRT-PCR结果表明,EmF3H基因在不同生长期各组织中均有表达,其中花期的根和果期的果实中表达水平最高。此结果为进一步研究EmF3H基因表达调控奠定了基础,也为完善斑地锦槲皮素生物合成途径提供了新思路。

斑地锦RT-qPCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的前提条件之一是具有合适的内参基因。为筛选斑地锦(Euphorbia maculata)合适的RT-qPCR内参基因,该文利用同源克隆法克隆斑地锦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段,RT-qPCR检测7个候选内参基因在斑地锦不同生长期根、茎、叶和果实中的表达情况,并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物学软件对各候选基因表达稳定性进行评价。结果表明:(1)克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段为729、808、753、422、233、656、313 bp,分别编码242、269、250、140、77、218、103个氨基酸,与其他植物相应氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。(2)综合3个分析软件分析内参基因表达稳定性得出,表达稳定性排名为UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此,可以选取UBQ作为斑地锦RT-qPCR分析的内参基因,用于不同生长期基因组织特异性表达研究。

斑地锦及近缘种的HPLC指纹图谱鉴别研究

为建立斑地锦(Euphorbia maculata L.)的HPLC指纹图谱分析方法并进行鉴别,采用PBONTOSIL KROMAPLUS 100-5-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以乙腈-0.1%磷酸系统为流动相,梯度洗脱:流速为0.8 mL/min;检测波长为360 nm;柱温为25℃。结果显示,斑地锦与千根草(Euphorbia thymifolia L.)、匍匐大戟(Euphorbia prostrata Ait.)、台西地锦[Euphorbia taihsiensis(Chaw et Koutnik)Oudejians]的HPLC指纹图谱均存在较显著差异;建立的HPLC指纹图谱方法能有效鉴别斑地锦及其近缘种。