细胞蛋白质组学和代谢组学整合策略表征散斑型BTB/POZ蛋白质突变调控的关键代谢通路

散斑型BTB/POZ蛋白(SPOP)是前列腺癌中突变率最高的蛋白质之一。该研究通过整合细胞蛋白质组学和代谢组学的方法,揭示SPOP突变引起的代谢紊乱及其调控的代谢通路。首先,系统地研究了LNCaP SPOP野生型及突变型高表达细胞中的代谢变化。代谢组学结果显示,SPOP野生型和突变型(SPOP_Y87N和SPOP_F133L)导入的LNCaP细胞在偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)得分图上得到了很好的区分。进一步通过单因素方差分析发现,SPOP突变引起富马酸、苹果酸、柠檬酸、天冬氨酸和天冬酰胺等代谢物含量的增加。蛋白质组学共发现909种蛋白质在两种LNCaP SPOP突变体细胞中发生变化。分别对差异代谢物和差异蛋白质进行通路富集分析,发现三羧酸循环、氨酰基-转运核糖核酸生物合成在代谢组学和蛋白质组学分析中都发生了明显改变。最后,在SPOP敲除的Du145细胞中验证了上述研究结果。该研究证明SPOP突变可促进三羧酸循环。

斑点型POZ蛋白对膀胱癌T24细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨RNA干扰斑点型POZ蛋白(SPOP)基因表达对人膀胱癌T24细胞生物学行为的影响。方法采用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将靶向沉默SPOP基因的小干扰RNA(siRNA)序列siRNA1和siRNA2分别转染至T24细胞株(siRNA1组和siRNA2组),设转染随机序列的T24细胞为对照组,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)和Western blotting分别检测各组转染48 h后的SPOP mRNA及蛋白水平,细胞增殖活性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞体外增殖活力,Transwell迁移试验及划痕试验观察各组的迁移能力。结果对照组、siRNA1组和siRNA2组的SPOP mRNA相对表达量为1.012±0.025、0.281±0.023和0.274±0.053,蛋白相对表达量为0.712±0.153、0.358±0.073和0.317±0.084,siRNA1组和siRNA2组的SPOP mRNA和蛋白水平均低于对照组(P<0.05),siRNA1组和siRNA2组SPOP mRNA和蛋白水平的差异无统计学差异(P>0.05);与对照组比较,siRNA1组和siRNA2组的增殖活性升高,差异有统计学意义(P<0.05),且siRNA1组和siRNA2组的增殖率随转染时间的延长而增加(P<0.05);Transwell迁移试验结果显示siRNA1组和siRNA2组的穿膜细胞数分别为(128.6±9.3)个和(134.5±8.6)个,均高于对照组的(92.5±8.4)个,差异有统计学意义(P<0.05);划痕试验结果显示siRNA1组和siRNA2组的划痕愈合率为(89.1±4.5)%和(93.7±5.1)%,均高于对照组的(32.6±2.8)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SPOP与膀胱癌的恶性行为有关,可能发挥抑癌基因的作用,如抑制增殖及迁移。

斑点型锌指结构蛋白在恶性肿瘤发生发展中的作用

恶性肿瘤居中国各类疾病死因之首,发病率与病死率呈逐年上升趋势。近几年来靶向治疗已广泛应用于临床,显示出良好的抗肿瘤效果,新靶点的探索和鉴定在靶向药物研发过程中起着重要作用。E3泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白(speckletype POZ protein,SPOP)作为治疗选择的潜在靶点,能特异性识别底物,使底物发生泛素化降解,广泛参与机体内多种生理、病理过程。研究发现SPOP基因突变或表达水平改变,通过调控AR/ERG、Akt-mTORC1、Hedgehog/Gli2等多种信号通路影响恶性肿瘤的发生发展,并与前列腺癌、肾癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤细胞增殖及远处转移密切相关。目前,SPOP影响恶性肿瘤发生发展的相关研究为靶向治疗恶性肿瘤奠定了基础,综述SPOP在恶性肿瘤的最新进展对抗肿瘤研究具有重要的意义。

膀胱癌及膀胱癌细胞株中斑点型锌指结构蛋白表达研究

目的观察斑点型锌指结构蛋白(SPOP)在膀胱癌组织及细胞株中表达情况。方法采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法分别检测膀胱癌组织与正常膀胱黏膜组织,不同膀胱癌细胞株与正常膀胱黏膜上皮细胞株SPOP mRNA表达量和SPOP蛋白表达量,比较分析两者表达情况。结果膀胱癌细胞株5637,T24,J82及正常膀胱细胞株SV-HUC-1中SPOP mRNA表达量分别为1.02±0.78,1.12±0.49,1.07±0.28,0.96±0.28;SPOP蛋白表达水平分别为0.44±0.16、0.38±0.27、0.14±0.33,0.72±0.24,膀胱癌细胞株与正常膀胱细胞株在SPOP mRNA水平表达差异无统计学意义(P>0.05)。而SPOP蛋白表达水平在膀胱癌细胞株与正常膀胱细胞株间差异有统计学意义(P<0.05)。SPOP mRNA表达水平在膀胱癌组织与正常膀胱黏膜组织间表达量差异无统计学意义(P>0.05),而SPOP蛋白表达水平在膀胱癌组织与正常膀胱黏膜组织间表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SPOP在膀胱癌组织中表达降低,在膀胱癌发生发展中可能起到抑制作用。SPOP可能通过转录后机制调控膀胱癌进程。

SPOP在机体发育中的作用

在胚胎发育中发挥重要作用的许多基因,其异常表达或突变常与疾病密切相关,斑点型BTB/POZ蛋白(speckle type BTB/POZ protein,SPOP)是其中之一。SPOP是E3泛素连接酶接头蛋白质,主要由MATH、BTB和BACK结构域构成,其功能正常发挥依赖于多个结构域各自不同的作用。SPOP主要通过泛素-蛋白酶体途径促进其靶蛋白质的降解来发挥作用。目前发现,SPOP底物蛋白质有30多种,其中大部分与前列腺癌、子宫内膜癌和肾癌的发生发展相关。SPOP在机体发育过程中也发挥重要作用,缺失或者突变SPOP导致小鼠出生后死亡。SPOP新生突变导致儿童神经发育障碍。SPOP调控机体发育也主要通过调控靶蛋白质降解来实现,包括作用于Gli2/3、PDX1、NANOG和SENP7等靶蛋白质来调控神经、骨骼和胰腺的发育以及衰老等过程。另有研究发现,SPOP与靶蛋白质会共定位到核斑(nuclear speckles)等无膜细胞器中,促进靶蛋白质的泛素化降解,并且SPOP寡聚体的形成以及其与底物多价互作引发的液-液相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)也在其中发挥了重要作用。SPOP寡聚化缺陷的BTB突变或BACK突变,可导致SPOP无法发生液-液相分离并定位于无膜细胞器。本文综合了最新研究进展,详细探讨了SPOP在机体发育过程中的重要作用。

SPOP调控Hh信号通路促进食管鳞癌细胞增殖和凋亡

目的探讨食管鳞状细胞癌(ESCC)SPOP表达对细胞增殖和凋亡的影响及相关机制。方法实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)对比SPOP在正常食管上皮细胞(HEEC)和ESCC细胞(ECA109、EC9706和TE-1)中的表达。敲低SPOP,qRT-PCR检测细胞转染效率。CCK8实验和细胞克隆形成实验检测SPOP对ESCC细胞的增殖影响。流式细胞术检测SPOP对ESCC细胞凋亡及周期的影响。qRT-PCR和蛋白质印迹法检测敲低SPOP后ESCC细胞Hh信号通路相关蛋白表达的变化。结果与HEEC细胞相比,SPOP基因在ECA109、EC9706和TE-1细胞中mRNA表达升高,t值分别为2.77、3.00和3.23,P值分别为0.047、0.038和0.026。CCK8实验结果显示,与对照组相比,敲低SPOP后,第1、2、3、4和5天ECA-109细胞的活性逐渐降低,F=10.12,P<0.001。细胞克隆形成实验结果显示,与对照组相比,敲低SPOP后,ECA-109细胞克隆形成数量减少,t=6.31,P=0.002。流式细胞术检测SPOP对ECA-109细胞凋亡的影响,结果显示,与对照组相比,SPOP敲低组细胞凋亡数增多,t=6.98,P=0.001。与对照组相比,SPOP敲低组中ECA-109细胞处于G_(1)期细胞比例增多(t=4.02,P=0.012),S期和G_(2)/M期细胞比例差异无统计学意义,P>0.05。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,抑制SPOP基因的表达后,Cul3基因在mRNA水平的表达增高(t=3.91,P=0.014),Gli3基因表达降低(t=14.20,P<0.001),而Gli1和Gli2基因表达差异无统计学意义,P>0.05。蛋白质印迹法结果显示,转染siSPOP后,Gli3和Gli1蛋白表达水平均降低(t值分别为4.89和7.21,P值分别为0.005和0.001),Gli2、Cul3和PSMC3蛋白表达水平均升高(t值分别为4.19、3.01和5.13,P值分别为0.011、0.038和0.005)。结论SPOP在ESCC中高表达,可能通过调控Hh信号通路促进ESCC细胞的增殖、抑制细胞凋亡和促进细胞G_(1)/S期转换。