斑点型POZ蛋白对膀胱癌T24细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨RNA干扰斑点型POZ蛋白(SPOP)基因表达对人膀胱癌T24细胞生物学行为的影响。方法采用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将靶向沉默SPOP基因的小干扰RNA(siRNA)序列siRNA1和siRNA2分别转染至T24细胞株(siRNA1组和siRNA2组),设转染随机序列的T24细胞为对照组,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)和Western blotting分别检测各组转染48 h后的SPOP mRNA及蛋白水平,细胞增殖活性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞体外增殖活力,Transwell迁移试验及划痕试验观察各组的迁移能力。结果对照组、siRNA1组和siRNA2组的SPOP mRNA相对表达量为1.012±0.025、0.281±0.023和0.274±0.053,蛋白相对表达量为0.712±0.153、0.358±0.073和0.317±0.084,siRNA1组和siRNA2组的SPOP mRNA和蛋白水平均低于对照组(P<0.05),siRNA1组和siRNA2组SPOP mRNA和蛋白水平的差异无统计学差异(P>0.05);与对照组比较,siRNA1组和siRNA2组的增殖活性升高,差异有统计学意义(P<0.05),且siRNA1组和siRNA2组的增殖率随转染时间的延长而增加(P<0.05);Transwell迁移试验结果显示siRNA1组和siRNA2组的穿膜细胞数分别为(128.6±9.3)个和(134.5±8.6)个,均高于对照组的(92.5±8.4)个,差异有统计学意义(P<0.05);划痕试验结果显示siRNA1组和siRNA2组的划痕愈合率为(89.1±4.5)%和(93.7±5.1)%,均高于对照组的(32.6±2.8)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SPOP与膀胱癌的恶性行为有关,可能发挥抑癌基因的作用,如抑制增殖及迁移。

SPOP在机体发育中的作用

在胚胎发育中发挥重要作用的许多基因,其异常表达或突变常与疾病密切相关,斑点型BTB/POZ蛋白(speckle type BTB/POZ protein,SPOP)是其中之一。SPOP是E3泛素连接酶接头蛋白质,主要由MATH、BTB和BACK结构域构成,其功能正常发挥依赖于多个结构域各自不同的作用。SPOP主要通过泛素-蛋白酶体途径促进其靶蛋白质的降解来发挥作用。目前发现,SPOP底物蛋白质有30多种,其中大部分与前列腺癌、子宫内膜癌和肾癌的发生发展相关。SPOP在机体发育过程中也发挥重要作用,缺失或者突变SPOP导致小鼠出生后死亡。SPOP新生突变导致儿童神经发育障碍。SPOP调控机体发育也主要通过调控靶蛋白质降解来实现,包括作用于Gli2/3、PDX1、NANOG和SENP7等靶蛋白质来调控神经、骨骼和胰腺的发育以及衰老等过程。另有研究发现,SPOP与靶蛋白质会共定位到核斑(nuclear speckles)等无膜细胞器中,促进靶蛋白质的泛素化降解,并且SPOP寡聚体的形成以及其与底物多价互作引发的液-液相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)也在其中发挥了重要作用。SPOP寡聚化缺陷的BTB突变或BACK突变,可导致SPOP无法发生液-液相分离并定位于无膜细胞器。本文综合了最新研究进展,详细探讨了SPOP在机体发育过程中的重要作用。

SPOP调控Hh信号通路促进食管鳞癌细胞增殖和凋亡

目的探讨食管鳞状细胞癌(ESCC)SPOP表达对细胞增殖和凋亡的影响及相关机制。方法实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)对比SPOP在正常食管上皮细胞(HEEC)和ESCC细胞(ECA109、EC9706和TE-1)中的表达。敲低SPOP,qRT-PCR检测细胞转染效率。CCK8实验和细胞克隆形成实验检测SPOP对ESCC细胞的增殖影响。流式细胞术检测SPOP对ESCC细胞凋亡及周期的影响。qRT-PCR和蛋白质印迹法检测敲低SPOP后ESCC细胞Hh信号通路相关蛋白表达的变化。结果与HEEC细胞相比,SPOP基因在ECA109、EC9706和TE-1细胞中mRNA表达升高,t值分别为2.77、3.00和3.23,P值分别为0.047、0.038和0.026。CCK8实验结果显示,与对照组相比,敲低SPOP后,第1、2、3、4和5天ECA-109细胞的活性逐渐降低,F=10.12,P<0.001。细胞克隆形成实验结果显示,与对照组相比,敲低SPOP后,ECA-109细胞克隆形成数量减少,t=6.31,P=0.002。流式细胞术检测SPOP对ECA-109细胞凋亡的影响,结果显示,与对照组相比,SPOP敲低组细胞凋亡数增多,t=6.98,P=0.001。与对照组相比,SPOP敲低组中ECA-109细胞处于G_(1)期细胞比例增多(t=4.02,P=0.012),S期和G_(2)/M期细胞比例差异无统计学意义,P>0.05。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,抑制SPOP基因的表达后,Cul3基因在mRNA水平的表达增高(t=3.91,P=0.014),Gli3基因表达降低(t=14.20,P<0.001),而Gli1和Gli2基因表达差异无统计学意义,P>0.05。蛋白质印迹法结果显示,转染siSPOP后,Gli3和Gli1蛋白表达水平均降低(t值分别为4.89和7.21,P值分别为0.005和0.001),Gli2、Cul3和PSMC3蛋白表达水平均升高(t值分别为4.19、3.01和5.13,P值分别为0.011、0.038和0.005)。结论SPOP在ESCC中高表达,可能通过调控Hh信号通路促进ESCC细胞的增殖、抑制细胞凋亡和促进细胞G_(1)/S期转换。