核酸斑点杂交技术快速鉴定转基因大豆品系

为了建立转基因大豆品系高通量检测方法,本研究以转基因大豆DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419、DP305423作为试验对象,根据品系特异的宿主与插入片断间连接区域的基因序列作为检测靶标,设计特异性引物。以转基因标准品为材料,提取DNA作为模板进行定性PCR扩增,尼龙膜点样,生物素探针制备,杂交与显色,并对探针浓度、杂交温度与时间与显色时长进行优化,利用优化后的反应条件对转基因大豆DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419、DP305423及空白对照样品进行检测,验证体系的特异性。将4种转基因大豆的DNA进行10倍系列稀释,利用优化后的反应条件测定灵敏度。对实验室收集的7个品系的转基因大豆标准品和8个能力验证样品进行适用性检测分析,并采用双盲验证法对17份盲样进行核酸斑点杂交测试分析,进一步验证体系的可靠性。结果表明,以转基因大豆DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419、DP305423为模版的扩增产物均有且只有一条清晰明亮的条带,大小均与理论相符,空白对照与内参照基因结果正常。4种转基因大豆特异性探针除对应样品有显色反应,对其他3种样品均未显色,具有方法特异性。样品DAS-68416-4、DAS-81419、DP305423最低检出限为20 pg·μL^(-1),样品DAS-44406-6最低检出限为2 pg·μL^(-1),具有较高的灵敏度。对7个标准品、8个能力验证样品和17份盲样的测试结果与SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检测方法》中的结果一致,可用于日常样品检测。本研究建立的定性PCR结合的核酸斑点杂交方法能对4种转基因大豆进行快速准确鉴定,对有序推进生物育种产业化应用,严查非法转基因种子市场流通和田间种植,保障粮食安全具有重要意义。

斑点杂交法检测SEN病毒感染

目的 :探讨斑点杂交法检测SEN病毒 (SENV)感染的应用价值 .方法 :应用地高辛标记、制备SENV部分基因探针并用斑点杂交技术检测SENVDNA ,与聚合酶链反应 (PCR)检测结果相比较 .结果 :在 191份血清中 ,采用斑点杂交法检出 6份阳性 ,检出率为 3.1% .PCR方法检测出 11份阳性 ,阳性率 5 .8% .结论 :制备的地高辛探针具有SENV特异性 ,以地高辛标记的SENV探针可用于检测SENV感染 .

应用RT-PCR、斑点杂交法和SDS-PAGE检测水稻黑条矮缩病毒

用RT PCR技术、PCR标记的探针点杂交和SDS PAGE检测了生产上严重危害玉米和水稻的水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)。由RT PCR扩增的RBSDV第 7片段第 92 1～ 14 11碱基作探针 ,用PCR法DIG标记后点杂交 ,可以从 10 0ng玉米病叶中检测到RBSDV ,灵敏度是RT PCR的 1/10 ;10 %SDS PAGE只能检测到从 1g玉米病叶中提取的病毒dsRNA ,但对江苏玉米田间分离的不同的RBSDV样品电泳发现 ,该病毒基因组dsRNA有差异 。

核酸斑点杂交分析法检测对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV)

于1995年7月在青岛市城阳对虾养殖场采集患暴发性流行病的中国对虾样品，提纯HHNBV并研制了一组地高辛标记的HHNBV核酸探针。采用核酸斑点杂交方法研究了此组核酸探针的灵敏度和特异性。结果表明，此组探针检测HHNBVDNA的灵敏度为62.5pg，对469ng病虾胃中的病毒可以检出；此组探针与3．75ug健康对虾组织和2ng健康对虾DNA均无交叉反应。1997年，应用此组特异性核酸探针检测了发病虾池对虾及紧急抢捕虾，检测结果显示为强烈的HHNBV阳性，表明此组核酸探针在对虾杆状病毒的检测、对虾暴发性流行病的诊断和抗特种病原对虾育种等方面具有很高的应用价值。

用DNA斑点杂交法检测对虾及其饵料和环境生物携带白斑综合症病毒状况的调查

于 1996～ 1998年采用DNA斑点杂交法 ,完成了共计 836份养殖对虾 ,2 13份对虾饵料和环境生物样品的检测。结果显示 ,对虾在每年的 4～ 10月都可检测出白斑综合症病毒 (WSSV) ,6月出现最高峰 ,阳性检出率达到 4 2 .6 % ;其次 ,为 7月和 5月 ,分别达 31.6 %和 2 4 .5 %。在对虾不同生长阶段 (包括亲虾、各期幼体、仔虾、幼虾及成虾 )均可检出WSSV ,其中以仔虾的带毒率最高 ,达 36 .4 % ,其次为糠虾幼体 ,达 34.6 %。体长范围 1.1～ 2 .0cm的仔虾阳性率最高 ,其次体长为 5 .1～ 6 .0cm的幼虾样品。检测的中国对虾样品(6 2 5份 )带毒率为 16 .8% ,日本对虾样品 (2 11份 )带毒率为 4 5 .0 %。对虾主要饵料及环境生物类群包括鱼类、虾类、蟹类、桡足类、端足类、沙蚕、卤虫均可检出WSSV ,其中小型虾类、端足类、桡足类、蟹类样品的WSSV检出率均高于 2 0 %。

反向斑点杂交法快速检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒

【目的】以克隆得到的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)基因片段为探针建立反向斑点杂交技术体系,应用于甘薯组培脱毒苗带毒情况检测,为生产优质甘薯组培脱毒苗提供保障。【方法】根据已公布的侵染甘薯的SPFMV和SPVG的核苷酸序列设计两对特异引物,以RT-PCR法从染病的甘薯叶片扩增SPFMV和SPVG的两个片段,并以克隆到的两个病毒片段及内参基因Actin片段为探针建立反向斑点杂交体系。【结果】分别克隆出长度约310和500 bp的片段,经BLAST比对,所获得的310 bp片段为SPFMV的外壳蛋白基因片段,同源性为97%,500 bp片段为SPVG的外壳蛋白基因片段,同源性为99%。分别用带有SPFMV和SPVG片段的重组质粒pUC-SPFMV和pUC-SPVG进行反向斑点杂交,发现不同病毒能获得单一信号,无交叉现象。以染病甘薯和脱毒甘薯苗为样品,用该种病毒的探针进行反向斑点杂交,染病植株样品中能获得单一信号,而脱毒苗甘薯样品未见任何信号,杂交结果与RT-PCR检测结果一致。【结论】用建立的反向斑点杂交技术体系能有效检测甘薯中的SPFMV和SPVG,无交叉信号,可用于甘薯组培脱毒苗的前期检测。

PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)

利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA探针,探针长度705bp,标记产量为20ng/μL。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,结果表明,该探针具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测IHHNVDNA的检出灵敏度为24.8pg,可检出26.6ng患病对虾组织DNA中的IHHNV,与250.4ng健康虾组织DNA、202.5ng健康虾匀浆液,白斑综合症病毒(WSSV)DNA和肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及IHHNV流行病学调查,并具有较高的应用价值。

应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌耐乙胺丁醇基因型的研究

应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对乙胺丁醇 (EMB)耐药性。设计与合成用于检测结核分支杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针 ,点于硝酸纤维素膜上 ,与结核分支杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应 (PCR)产物进行反向斑点杂交 ,并与PCR 单链构象多态性 (PCR SSCP)和PCR 直接测序 (PCR DS)结果比较。对 81株结核分支杆菌临床分离株进行分析 ,31株EMB敏感株中 ,2 6株embB基因的SSCP图谱、膜反向斑点杂交结果与标准株 (H37Rv)完全相同 ;其余 5株SSCP图谱出现泳动变位 ,其中 3株E1b杂交阳性 ,PCR DS分析为embB基因 30 6位密码子ATG→GTG突变 ;2株E1d杂交阳性 ,PCR DS分析为embB基因 30 6位密码子ATG→ATA突变。 5 0株耐EMB菌株中 ,2 4株PCR SSCP图谱与标准菌株相同 ,E1杂交阳性 ;2 6株PCR SSCP图谱出现泳动变位 ,其中 18株E1b杂交阳性 ,2株E1c杂交阳性 ,5株E1d杂交阳性 ,1株E1e杂交阳性 ,未发现E1f杂交阳性 ,与PCR SSCP、PCR DS分析结果一致。突变检出率为 5 2 %。膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分支杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。

地高辛标记探针检测5种葫芦科作物病毒的斑点杂交方法

【目的】探索5种葫芦科作物病毒即小西葫芦黄花叶病毒(Zuccini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot viruswatermelon strain,PRSV-W)和南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)的斑点杂交检测技术,为葫芦科作物种子带毒的快速准确鉴定、流行病学研究和转基因检测等提供技术和方法。【方法】以构建的重组质粒为模板,用PCR方法合成了相应的地高辛标记的cDNA探针。通过斑点杂交检测西葫芦病叶汁液来考察探针的灵敏性和特异性。同时设计了3种不同长度的SqMV探针(0.55、1.6、2.7kb)对杂交效果进行了研究。【结果】ZYMV、WMV、CMV、PRSV-W和SqMV的5种探针检测各自侵染西葫芦病汁液的稀释低限分别为1﹕160、1﹕160、1﹕320、1﹕160、1﹕320,而每种探针与健康西葫芦和其它4种病毒的反应均为阴性。不同长度的SqMV探针杂交结果相同。【结论】用PCR方法合成的地高辛标记的探针,能够直接在植物组织中将5种病毒检测出来,具有较好的灵敏性、特异性和重复性。探针的长度对杂交的灵敏性和特异性没有影响。

PCR和斑点杂交检测鸡传染性贫血病毒

通过聚合酶链反应（ｐｃＲ）扩增鸡传染性贫血病毒（ｃＡＶ）ＤＮＡ特定片段，将此ｐｃＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记后作为探针进行斑点杂交，以此检测ＣＡＶ并作流行病学调查。对从江苏省不同地市随机采集的２月龄左右不同疾病的病鸡ＤＮＡ样品进行检测，在被检的５２个不同鸡群来源的病料中，有３６个鸡群来源的病料ＤＮＡ显示ＣＡＶ阳性（群阳性率为６９．２％）；备组织中ＣＡＶＤＮＡ含量有所差异，依次为胸腺＞脾、骨髓、肝＞肾、法氏囊、脑。用ＰＣＲ检测得到的阳性鸡的组织病料感染ＳＰＦ鸡，在感染后第２４天检查，出现贫血症状。初步调查表明，在江苏一些地区ＣＡＶ感染已相当普遍，但它与发病的关系还有待于进一步研究。

PCR-核酸探针斑点杂交法检测痕量白斑综合征病毒（WSSV）

设计了2对引物用于检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)，外引物用于PCR扩增，内引物用于合成探针进行斑点杂交。结果表明，外引物PCR-电泳的检出极限为1pg WSSVDNA；PCR产物经内探针斑点杂交，可检出10fg的WSSV DNA；单纯的内探针斑点杂交只能检测出1ng以上的WSSV DNA。PCR-斑点杂交的检测灵敏度比PCR-电泳高2个数量级，比单纯斑点杂交高5个数量级。Southern杂交表明，PCR-斑点杂交检测WSSV特异可靠。该方法可用于痕量WSSV的检测。

用斑点杂交法同时检测鸡群中的CAV MDV和REV

为研究鸡传染性贫血病毒(CAV)在鸡群中的感染状况以及马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮细胞增生病病毒(REV)在鸡群中的发病率,用斑点杂交法对山东省4个肉鸡场和2个肉种鸡场进行CAV、MDV和REV的检测,结果表明除一个肉种鸡场没有检测出REV以外,其他鸡场均同时检测出CAV、MDV和REV,并且发现直接从病料中检测CAV的阳性率(20％)远远低于将病料接种SPF鸡胚后的检出率(80％)。

铜绿假单胞菌oprI基因的反向斑点杂交检测法

目的建立一种早期快速检测铜绿假单胞菌的方法。方法根据铜绿假单胞菌特异的oprI基因设计引物,聚合酶链反应合成特异探针,光敏生物素标记细菌DNA,应用反向斑点杂交法检测铜绿假单胞菌。结果所合成的探针具有高度特异性,能鉴别铜绿假单胞菌,与其他细菌、病毒、真菌间无交叉反应。该方法能检测出100 ng细菌DNA。结论反向斑点杂交法具有快速、特异的优点,对铜绿假单胞菌的早期检测具有重要意义。

膜-反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌

目的探讨膜-反向斑点杂交技术(RDB)在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值。方法以97例病理石蜡组织、97例肺泡灌洗液为研究对象,分别以膜-反向斑点杂交、实时荧光PCR(RT-PCR)、抗酸染色三种方法检测结核杆菌,对三种方法进行方法学评价。结果结核组病理石蜡组织、肺泡灌洗液三种方法检测的总阳性率分别为:抗酸染色为32.8%,RT-PCR阳性率为82.8%,RDB阳性率为89.9%,两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05),对照组三种方法检测结果均为阴性;三种结核杆菌的检测方法的方法学评价,RDB灵敏度(90.6%)、约登指数(0.91)、符合率(93.9%)、阴性预测值(85.0%)均较好。结论膜-反向斑点杂交技术在病理石蜡组织和肺泡灌洗液结核杆菌的检测上有很高的临床应用价值,值得临床推广应用。

应用反向斑点杂交技术进行脐血HLA-DRB基因分型方法的建立

HLA分子的多态性对于移植有十分重要的意义。常用的HLA基因分型方法中SSOP基因分型方法有较高分辨率 ,但操作过程复杂 ,仅适于大样本的HLA分型。PCR SSP基因分型方法分辨率较低 ,但操作过程简单 ,适于临床要求。有必要建立一种简便、快速、价廉、高分辨率的基因分型方法。本研究取 6 3份已知HLA DRB型的脐血标本 ,经盐酸胍方法提取DNA用于反向斑点杂交 (RDB)基因分型 ,同时采用SSOP和PCR SSP方法进行比较。结果表明 ,所有样本用RDB方法基因分型均获得成功 ,可准确地分辨 6 0个HLA DRB等位基因 ,且结果与用SSOP和PCR SSP方法的结果完全一致。结论提示 ,RDB方法可准确地分辨HLA DRB等位基因 ,分辨率高 ,操作简单 。

反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异的应用和评价

【目的】采用反向斑点杂交技术对拉米夫定治疗后的慢性乙型肝炎患者血清中HBV YMDD基序变异进行检测,并对其临床应用进行方法学评价。【方法】提取242例慢性乙型肝炎患者血清中HBV DNA,经聚合酶链反应后进行膜条杂交并同测序比较分析检测结果的一致性,随后对该方法进行灵敏度和混合感染检测能力的评价。【结果】242例样本检测结果有236例与测序结果相符,反向斑点杂交检测结果同测序结果的符合率达97.5%;混合型感染58例,占样品总数的24%。反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异的灵敏度达103IU/mL,在病毒混合感染群体中能检测出约占10%的突变型病毒株。【结论】反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异具有简单、准确、经济实用的特点,具有很好的临床应用前景。

反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因

目的:观察膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药性的效果。方法:用ropB、katG、inhA、rpsL基因的寡核苷酸探针与结核分枝杆菌PCR产物进行反向斑点杂交,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较。结果:INH、RFP和SM的耐药基因检测灵敏度分别为84.88%、87.10%和79.17%,符合率为97.33%、94.74%和88.37%。结论:膜反向斑点杂交技术是检测部分MTB耐INH、RFP和SM基因型快速、简便的方法。

改进探针标记法斑点杂交在轮状病毒VP7分型中的应用

目的建立一种更加简便的A组人轮状病毒(HRV)核酸斑点杂交VP7分型方法,以便用于对HRV流行情况进行调查。方法在HRVVP7编码基因各G基因型间高度变异而型内高度保守区域设计分型探针,在该区域的两侧相对保守区域设计一对通用引物,利用PCR分别将地高辛标记HRV5种常见型别(G1～4,G9型)的DNA探针,建立基于VP7的斑点杂交方法;选取经抗原检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测均为HRV阳性的2006至2008年住院腹泻患儿粪便标本200份,RT-PCR扩增VP7全基因,并对扩增阳性产物应用斑点杂交方法进行G型别分析。结果建立的斑点杂交方法在5种型别探针间无交叉反应,各型探针的检测灵敏度可达到10pg。200份PAGE阳性标本中162份RT-RCR扩增VP7基因阳性,斑点杂交显示G1型41例(25.3%),G2型2例(1.2%),G3型63例(38.9%),G9型35例(21.6%),混合感染19例(11.7%),杂交未分出型2例(1.2%),未检测到G4型HRV。结论本研究所建立的斑点杂交方法敏感度和特异度强,适合在HRV大规模分子流行病学调查时应用。通过该方法的初步应用,发现北京地区婴幼儿HRV除了常见的G1、G2和G3型外,还有G9型感染。

鉴定海参的斑点杂交法及其应用

本研究目的是通过斑点杂交方法对不同种类的海参进行快速准确的鉴定。采用CTAB沉淀法提取海参的DNA,PCR扩增线粒体COⅠ基因并测序,利用Primer premier 5.0软件设计并筛选了仿刺参(Apostichopus japonicus)、北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)、加州红参(Parastichopus californicus)及梅花参(Thelenota ananas)4种海参的特异性探针,设计并进行斑点杂交实验。实验结果显示:4条探针均具有高度的特异性,灵敏度可达100pg,能够实现对仿刺参、北大西洋瓜参、加州红参和梅花参的准确鉴定。本文建立的斑点杂交方法,为海参品种的快速、准确的鉴定提供了可靠的技术方法。

应用核酸斑点杂交法检测鹅细小病毒(GPV)

利用鹅细小病毒 (GPV)核酸探针 ,设计并建立了核酸斑点杂交法 ,用以检测 GPV核酸。该方法特异性与敏感性均较好 ,其敏感度可达 3pg。应用该方法对 4例病变典型的小鹅瘟患鹅组织器官进行检测 ,结果表明 ,患鹅脏器中 ,小肠、心、肝、胰、脾组织含毒量较高 ,其中小肠组织含毒量最高 ,而脑组织中含毒量较低。应用琼脂扩散试验验证了核酸斑点杂交法的检测结果。