黑龙江逊克地区森林革蜱斑点热立克次体DNA的检测

目的调查黑龙江逊克地区蜱传斑点热自然疫源地,发现该地区蜱携带斑点热立克次体的种类。方法采用斑点热立克次体ompA和gltA基因特异的PCR,检测该地区森林革蜱的DNA样本,并对扩得阳性产物进行测序和聚类分析。结果从60只森林革蜱中检测有14只扩得斑点热立克次体ompA和gltA基因片段,阳性率为23.33%。随机选择2只蜱的阳性片段进行测序,二者同源性为100%,ompA基因序列与Rickettsia sp.JL-02同源性为99.30%,与Rickettsia raoultii为99.18%。结论黑龙江省逊克地区森林革蜱携带与Rickettsiasp.JL-02株亲缘关系相近的斑点热群立克次体。

日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码蛋白的生物信息学和B细胞抗原表位分析

目的对从我国临床患者血液中新发现和分离出的日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码蛋白进行系统的结构与功能预测,为深入了解其在立克次体致病机制中的作用、研发斑点热临床诊断试剂和疫苗提供理论基础。方法基于日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码的氨基酸序列,应用生物信息学方法预测其信号肽、跨膜区、疏水性等性质和可能的B细胞抗原表位。结果日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因在3 297~3 311处存在连续15个碱基的缺失,除此之外,该分离株还有4个碱基突变。该基因编码的氨基酸数目为1 651个,蛋白质分子量为167.69 ku,共由20种氨基酸组成,其中含量较多的氨基酸是Gly;理论等电点pI为5.15,消光系数为58 805或58 680,蛋白不稳定指数为7.15,脂肪指数为88.86,总平均亲水性(GRAVY)为0.06,为疏水性蛋白;Signal peptide (Sec/SPI) Likelihood为0.567 7,有信号肽序列;存在一个Pfam区域和自转运体区,分别与细菌黏附宿主和蛋白质转运有关;蛋白二级结构中以无规卷曲为主,其次为β-折叠和α-螺旋,分别占到53.73%、30.83%和15.45%。同源模建蛋白的三级结构中,第1 308~1 651氨基酸部分在蛋白表面形成桶状结构,可能具有丝氨酸蛋白酶的作用;蛋白分子内抗原表位较丰富,共有159个可能的抗原表位,预测分数最高(0.94)的为1 269~1 284位序列。结论成功分析和预测了日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码蛋白的组成、蛋白质的二级结构、三级结构和B细胞抗原表位,为研究日本斑点热立克次体的致病机制、临床诊断试剂和亚单位疫苗的研发提供了理论支持。

一株斑点热立克次体的病原学研究

自内蒙古自治区的草原革蜱（D．nuttalli）中分离到一株斑点热立克次体。用微量酶标染色方法进行血清学鉴定表明，系西伯利亚（Rickettsiaesibirica种血清型。G＋Cmol％含量为32.4％。对其核酸进行聚合酶链扩增／限制性核酸内切酶消化（PCR／RFLP）分析DNA长度多态性，分别引用立氏立克次体蛋白抗原基因Rr190序列作为扩增引物Rr190．70p～602n和Rr190．4442p～5664n，扩增后分别用Pst1和Rsal限制性核酸内切酶消化。其电泳图谱证明，该分离株的DNA多态图谱与R．sibirica完全一致。上述结果可确证该分离株为西伯利亚斑点热立克次体种，称内85011株即NM-8501。

我国斑点热立克次体感染与免疫的实验研究

研究证明黑龙江立克次体能够感染人血管内皮细胞和BALB/c小鼠,引起小鼠菌血症和器官损伤;全基因组序列分析发现黑龙江立克次体毒力相关基因。表面蛋白质组分析鉴定了黑龙江立克次体和立氏立克次体的表面蛋白,用表面蛋白免疫C3H/HeN小鼠,发现某些表面蛋白为保护性抗原,并揭示这些保护性抗原均能够诱导抗原特异CD4+和CD8+T细胞增殖并产生和分泌IFN-γ和/或TNF-α,以及诱导高水平特异性IgG2a产生,在这些免疫因素的协同作用下使小鼠有效抵抗立克次体感染。用黑龙江立克次体感染Tim-3高表达或低表达人血管内皮细胞以及Tim-3高表达转基因小鼠,结果有力证明Tim-3高表达能够促进人血管内皮细胞和小鼠抵抗黑龙江立克次体感染。

我国斑点热立克次体生物学特性及分子流行病学研究

本研究为平战结合的基础研究。作者采用分子生物学方法证实了我国有三个斑点热立克次体(SFGR)种:西伯利亚(R.sibirica)种及其亚种和两个新种——黑龙江斑点热立克次体和内蒙古斑点热立克次体;在国际上首先证实了康氏立克次体株间差异性,在种水平上的分类鉴定获得成功;在我国首次从病人分离到SF-

新疆部分地区蜱传斑点热立克次体的分子流行病学研究

【目的】调查新疆地区斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)在蜱虫中的感染情况及其分布.【方法】2018年4~5月,采用人工布旗法对新疆地区10个县(市)的游离蜱和寄生于家畜体表的蜱虫进行采集并鉴定.对采集的蜱虫提取基因组,利用SFGR特异引物对提取的基因组进行PCR扩增及测序分析,用MEGA 6.0软件构建分子系统进化树.【结果】共采集蜱虫2 079只,经鉴定分析,采集的蜱种包括革蜱属、璃眼蜱属和扇头蜱属3属的7个种.扩增得到了包括拉欧蒂立克次体(Rickettsia raoultii)、斯洛伐克立克次体(Rickettsia slovaca)等在内的4种已知SFGR和2株未定种.对其阳性率进行统计结果表明,不同地区的蜱虫阳性率为40%~80%,平均阳性率为51.5%;不同蜱种间的感染率为1.1%~80%.【结论】通过对新疆地区SFGR病原的流行病学调查表明,被检地区SFGR病原阳性率较高,存在2种病原交叉感染现象,且扩增到的病原多属我国少见的人兽共患病病原.

日本斑点热立克次体近缘株重组OmpB蛋白抗原性研究

目的探讨关于斑点热立克次体的临床诊断及流行病学调查而进行的诊断方法学研究。方法构建R.Japonica Anhui 120 strain OmpB原核表达质粒,表达、鉴定并纯化重组蛋白,用其作为抗原建立间接ELISA检测方法,检测120份临床样本中日本斑点热立克次体特异性IgG抗体,并评价方法的敏感性和特异性。结果获得了高表达、高纯度的OmpB重组蛋白,建立的间接ELISA方法体系与美国食品和药物管理局认可的诊断试剂盒相比有良好的特异性和敏感性,两者的特异性为100%,敏感性为96.7%,符合率为99.2%,Kappa值为0.98。结论 OmpB重组蛋白具有很好的免疫反应性,能特异地检出斑点热立克次体IgG抗体,间接ELISA方法可作为临床诊断的技术储备及流行病调查和科学研究。

实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体方法的建立

目的建立斑点热群立克次体(SFGR)TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法。方法根据日本斑点热立克次体外膜蛋白A(ompA)基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的此检测方法和常规的巢式PCR方法同时对临床收集的80份患者血标本进行检测并比较两者结果。结果成功建立了检测SFGR的实时荧光定量PCR方法,标准曲线的循环阈值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(r>0.99),且在检测SFGR核酸样本时具有良好的灵敏度、特异性和重复性。结论该研究建立了基于TaqMan探针检测SFGR的实时荧光定量PCR检测方法,为临床实验室快速确诊SFGR疾病提供了快速、有效的技术手段。

广东连平县存在新的蜱传斑点热立克次体

目的对采自广东省连平县的3种硬蜱进行蜱传斑点热立克次体检测分析。方法斑点热立克次体的ompA基因片段扩增并测定扩增片段的DNA序列。结果20只蜱分为17组,其中15组PCR检测阳性。对4个测序成功的标本进行聚类分析,证实其中3个序列单独聚为一类,与引起Flinders岛蜱传斑点热的弗诺立克次体(R.honei)、非洲蜱咬热的非洲立克次体(R.africa)、未定名斑点热的斯洛伐克立克次体(R.slovaca)以及西伯利亚立克次体BJ-90株等亲缘关系较近,另一序列与我国长白山地区检测到的JL-02具有较高的同源性。结论本研究提示该地区除了已证实的西伯利亚斑点热外,还存在新的蜱传斑点热。

微波微量免疫荧光检测斑点热立克次体方法的建立

目的 建立微波免疫荧光检测斑点热立克次体的方法。方法 通过微波促免疫荧光染色最佳时间、最佳火力的选择及微波免疫荧光方法与常规免疫荧光方法敏感性的比较。结果表明 :微波法反应速度快 ,只需 15min就可以观察结果 ,大大缩短了检测时间 ,提高了工作效率 ,并且两种方法在特异性上没有显著性差别。结论 我们认为微波免疫荧光方法是一种简便的、实用的快速检测立克次体的方法。

斑点热立克次体病在美国呈大幅增长

据美国亚特兰大疾控中心报道,近年来出现了前所未有的蜱传播性疾病,但尚不清楚是否导致了相应发病率的实际增加。其中斑点热立克次体病(spotted fever rickettsiosis,SFR)数量增幅最大,从2016年的4269例上升至2017年的6248例,增长46%,其中2017年报告确诊的为176例(3%),其余为极有可能;病死率高达10%。

四川省炉霍县牦牛源蜱传斑点热群立克次体和无形体分子检测及遗传进化分析

【目的】了解四川省炉霍县牦牛体表寄生蜱的种类及其斑点热群立克次体(Spotted fever group Rickettsia,SFGR)和无形体的感染情况。【方法】在炉霍县6个乡采集牦牛体表的蜱,经形态学初步鉴定后提取蜱基因组DNA,采用PCR技术分别扩增蜱ITS⁃2、SFGR OmpB和无形体16S rRNA基因部分片段,对阳性产物进行测序、比对及构建进化树,从而确定蜱的种类及其SFGR和无形体的感染情况。【结果】在820份蜱样本中,只包含青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensisus,29/820)和微小扇头蜱(Rhipicephalus micro⁃plus,791/820)。总共有408份蜱样本被检出SFGR,只检出Candidatus Rickettsia longicornii 1种SFGR,总感染率为49.8%(408/820)。本次调查的6个乡均检出SFGR,不同乡之间SFGR感染率的差异极显著(χ^(2)=111.524,P=0.000<0.01)。青海血蜱和微小扇头蜱的SFGR感染率分别为44.8%(13/29)和49.9%(395/791),差异不显著(χ^(2)=0.292,P=0.589>0.5)。有5个乡检出无形体,共检出Anaplasma bovis、A.marginale、A.platys和A.phagocytophilum 4种无形体,总感染率为30.9%(253/820),不同乡之间蜱样本无形体感染率差异极显著(χ^(2)=139.825,P=0.000<0.01)。青海血蜱和微小扇头蜱的无形体感染率分别为6.9%(2/29)和31.7%(251/791),差异极显著(χ^(2)=8.087,P=0.004<0.01)。SFGR与无形体混合感染率为18.8%(154/820)。【结论】炉霍县存在青海血蜱和微小扇头蜱,还携带SFGR和多种无形体,应做好当地蜱传斑点热群立克次体和无形体的防治工作。

吉林省长白山区斑点热立克次体自然疫源地调查

目的 了解吉林省长白山区蜱传斑点热的自然疫源地情况。方法 利用立氏立克次体[相对分子质量 (Mr) 190× 10 3 ]外膜蛋白A(R .rOmpA)基因序列设计引物 ,对 6 83只蜱类标本进行聚合酶链反应 (PCR)检测 ,并随机抽取一株森林革蜱阳性扩增产物进行克隆与序列测定。结果 从森林革蜱和嗜群血蜱标本中检测出了斑点热立克次体DNA片段 ,阳性率分别为 5 3.81%和 7.4 1% ;所测序列与前苏联的DnS 14株的同源性为 10 0 .0 0 % ,与DnS 2 8和RpA 4的同源性均为99.0 0 % ;而与国内所检测的BJ 90、HLJ 0 5 4的同源性分别为 88.0 0 %和 86 .0 0 %。结论 长白山区存在斑点热的自然疫源地 ,存在与DnS 14株型别一致的斑点热立克次体 ,在中国系首次发现。

我国西部地区蜱类携带斑点热群立克次体现状

近几十年来,蜱传疾病已经成为一个全球性的健康问题。在世界范围内斑点热群立克次体(SFGR)被认为是重要的蜱传病原体。伴随着全球一体化进程的加快,近年来在我国西部地区多次发现蜱传新发再发病原体。本文主要针对我国西部地区蜱虫携带斑点热群立克次体现状进行了简要概述,以期为我国西部地区蜱传斑点热群立克次体疾病的系统研究和综合防控提供参考信息。

浙江省在蜱中检测到斑点热群——立克次体DNA片段

目的了解蜱、鼠中自然感染斑点热群立克次体的状况。方法用聚合酶链反应(PCR)检测鼠类脾脏和蜱类中的斑点热DNA片段。结果在金华市金东区捕获社鼠2只,黄毛鼠10只,黑线姬鼠4只,用PCR检测结果均为阴性。用PCR检测49只中华硬蜱,阳性8只,阳性率16.33%。结论初步认定浙江省存在斑点热病原,尚需进一步调查。

中哈边境艾比湖湿地游离蜱斑点热群立克次体的分子流行病学研究

了解中哈边境新疆艾比湖湿地游离蜱中斑点热群立克次体的感染情况。利用斑点热群立克次体外膜蛋白A(ompA)基因对艾比湖湿地游离亚洲璃眼蜱、边缘革蜱、血红扇头蜱进行PCR检测,并对阳性样本进行测序和BLAST序列分析,并应用Mega5.0软件建立分子系统进化树。结果中哈边境地区艾比湖湿地游离蜱斑点热群立克次体电泳阳性率36.84%(56/152),BLAST分析显示,艾比湖湿地游离蜱斑点热群立克次体基因型为Rickettsia raoultii,与从匈牙利患蜱传染的病人肿大淋巴结中分离获得的R.raoultii关系最近,处于同一分支(Gen Bank登录号为JQ798904)。结论是新疆艾比湖湿地游离蜱斑点热立克次体感染较为严重,存在立克次体自然疫源地,应尽快制定防制措施,以免危机动物及人类健康。

190kDR.rOmpA基因序列对斑点热群立克次体的检测

目的为探讨190 kD R.rOmpA 基因序列对斑点热群立克次体的检测作用。方法从立氏立克次体190 kD 外膜蛋白 A(R.rOmpA)基因序列设计引物,利用 PCR 检测的方法,检测了683只蜱类标本和146个鼠类脏器标本,并随机抽取1株森林革蜱阳性扩增产物进行克隆与序列测定。结果从蜱类标本和鼠类脏器标本中检测出了斑点热立克次体 DNA 片段;所测序列的分型结果表明与前苏联的 DnS 14株型别一致,与我国曾经检测出的斑点热立克次体株差异较大。结论 190kD 外膜蛋白 A 基因序列可用于斑点热立克次体检测,并可用于斑点热群立克次体基因型或亚型之间的鉴别。

中国黑龙江斑点热立克次体和日本斑点热立克次体基因型和血清型的比较

中国黑龙江斑点热立克次体和日本斑点热立克次体先后被鉴定为斑点热群中的两个新种。通过采用微量免疫荧光方法和聚合酶链扩增／限制性内切酶片段长度多态性分析技术，对两株斑点热立克次体进行了比较。结果显示，黑龙江立克次体抗血清与日本株抗原无交叉反应，黑龙江立克次体抗原与日本株抗血清仅呈低滴度反应。同时采用获自主氏立克次体蛋白抗原Ｒｒ１９０序列的一对寡核苷酸序列作为引物扩增上述两株立克次体后，用限制性内切酶ＲｓａＩ消化扩增产物，其Ｒｒ１９０－ＲｓａＩ图谱说明，两株的酶切带的迁移率明显不同。