青蒿中番茄斑萎病毒和烟草花叶病毒的分子鉴定及相关序列分析

番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)是2种重要的植物病原病毒,对多种经济作物的产量和品质均造成严重影响。2021年-2022年,在云南省丽江市烟草种植区不同烟区采集叶片黄化、皱缩以及无症状的青蒿Artemisia caruifolia样品共计14份,利用免疫金标速测卡和RT-PCR对其病原病毒进行检测。利用免疫金标速测卡检测结果显示,在所检样品中有9份样品检测出TSWV,检出率为64.28%,有3份样品检测出TMV,检出率为21.43%,2种病毒复合侵染的检出率同样为21.43%;利用RT-PCR对复合侵染的3份样品进行分子检测,结果显示,在3份复合侵染青蒿样品中获得3条TSWV N基因序列、3条TMV cp基因序列和2条TMV RdRp部分序列。TSWV青蒿分离物与分离自云南的TSWV-2分离物相似性最高,为99.6%;TMV青蒿分离物与分离自辽宁的TMV-Shenyang分离物和分离自云南的TMV-Yongren-1相似性最高,均大于99.4%。这是首次发现TSWV和TMV 2种不同属病毒复合侵染青蒿。

烟草番茄斑萎病毒RT-LAMP检测体系的建立及优化

为快速检测烟草番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),基于TSWV核外壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)保守序列设计5组引物进行筛选,采用单一变量法对反应温度、时间及反应体系中dNTPs、Mg^(2+)、甜菜碱的含量和内外引物比等参数进行优化,建立烟草TSWV反转录环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测体系,并采用RT-PCR(revers transcription-polymerase chain reaction)检测方法进行平行比对试验,验证优化后RT-LAMP的特异性、灵敏性及实用性。结果表明,烟草TSWV RT-LAMP检测体系最佳引物组为TS-N-4,在25μL的反应体系中各组分最佳加入量为缓冲液2.5μL、100 mmol·L^(-1) MgSO40.5μL、10 mmol·L^(-1) dNTPs 0.5μL、10 mmol·L^(-1) FIP/BIP 1.5μL、10 mmol·L^(-1) F3/B30.5μL、10 mmol·L^(-1) LF/LB 1.5μL、5 mmol·L^(-1) Betaine 6μL、Bst 2.0 WarmStar DNA Polymerase(8000 U·mL-1)0.5μL、M-MLV酶(10000 U·mL^(-1))0.125μL、RNA(≥64.7 fg)1μL,DEPC H2O补至25μL;最佳反应温度和时间分别为58℃、60 min。优化后的RT-LAMP灵敏度是RT-PCR的1000倍,且田间样品检测结果与RT-PCR相符。建立的RT-LAMP方法特异性强、灵敏度高、操作简单,对于烟草TSWV的检测及监控有重要意义。

番茄斑萎病毒蛋白结构及其抑制剂作用机制研究进展

番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)基因组可编码RdRp、NSm、NSs、Gc、Gn和N等多种蛋白,目前,相关研究主要集中在植物(番茄和辣椒)对TSWV的抗病基因(Sw-5b和Tsw)所介导的抗性以及药剂对TSWV N蛋白的抑制作用。TSWV蛋白具有作为药剂分子靶标的潜力,但关于TSWV蛋白与药剂的作用机制尚未见系统、全面的研究报道。本文从结构生物学的角度出发,详细介绍了目前已经被解析的TSWV病毒蛋白三维结构,并通过AlphaFold2模型预测了尚未被解析的4种TSWV蛋白结构;同时,综述了TSWV抗性基因和TSWV抑制剂在植物保护领域的研究应用进展。以宁南霉素、盐酸吗啉胍和利巴韦林等药剂为例,分析其可能作用于TSWV蛋白的分子机理,并预测了这些药剂与TSWV蛋白可能的作用位点,旨在为后续深入挖掘和探索新型抗TSWV药剂提供理论依据。

贵州辣椒番茄斑萎病毒的分子鉴定

用RT-PCR法对采自贵州6个地区的疑似辣椒病毒病样品进行了番茄斑萎病毒(TSWV)的鉴定,并用分子克隆方法扩增不同地区的感染TSWV的N基因序列。结果表明:贵州贵阳、安顺、瓮安、福泉、长顺和惠水的辣椒上均存在TSWV,经序列比对,贵州辣椒TSWV分离物核苷酸一致性为95.6%~99.7%,氨基酸一致性为97.1%~100.0%;通过系统进化树分析,福泉、惠水和长顺辣椒TSWV分离物与云南、山东的番茄TSWV分离物亲缘关系较近,安顺、贵阳和瓮安辣椒TSWV分离物与云南的番茄、辣椒、烟草、芹菜和鬼针草TSWV分离物,以及江苏的莴苣TSWV分离物亲缘关系较近。表明贵州辣椒TSWV分离物有2种株系,与国内不同地区不同寄主的TSWV分离物具有一定的相关性。

北京地区侵染茄子的番茄斑萎病毒分子鉴定与分析

调查发现北京地区一温室栽培茄子Solanum melongena L.出现严重病毒病。利用基于小RNA的高通量测序技术和RT-PCR方法,明确了引起茄子病害的病毒种类为番茄斑萎病毒,将其命名为TSWV-eggplant分离物。进一步克隆了该病毒的基因组全长(S RNA、M RNA、L RNA),并构建其系统发育树。结果表明,该分离物的S RNA与美国分离物亲缘关系较近,M RNA与中国分离物亲缘关系较近,而L RNA与韩国分离物亲缘关系较近。因此,本研究发现的TSWV分离物与国内已发生报道的分离物不同,该分离物是否存在不同分离物之间基因组的重组需要进一步研究。

番茄斑萎病毒病防治把好五个关口

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是番茄上一种重要病害,严重威胁番茄生产安全。根据多年研究与生产实践,总结了番茄全生育期TSWV防治需要把好的五个关口:把好种子处理关、把好种苗调运关、把好植株营养关、把好传毒昆虫防治关、把好病毒病治疗关。

甘肃省辣椒斑萎病毒的检测

在甘肃省兰州、白银、庆阳采集发病症状表现为植株矮化、叶片黄化、生长点坏死的辣椒病样,采用RT-PCR法和简易试纸条进行病毒检测。结果表明:通过RT-PCR法共检测出了6种病毒:辣椒环斑病毒(ChiRSV)、辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)、辣椒斑驳病毒(PepMoV)、辣椒叶脉黄化病毒(PeVYV)、烟草轻绿花叶病毒(TMGMV)、番茄斑萎病毒(TSWV);且在同一个病样上,存在多种病毒复合侵染的状况。利用简易试纸条进行检测,只检测出了TSWV,但检出率较高。表明,甘肃地区辣椒生产上侵染的病毒种类多,TSWV的发生越来越普遍和严重。

西藏昌都市卡若区蔬菜主要病毒检测及番茄斑萎病毒鉴定

为明确西藏昌都市卡若区高原条件下的蔬菜主要病毒种类,对温室、大棚和露地栽培的主要蔬菜进行了病毒病调查,采集典型病毒病症状样品进行ELISA检测,明确病毒种类;并利用电子显微镜观察,RT-PCR扩增克隆与测序分析对主要病毒进行鉴定分析。ELISA检测结果表明,西藏昌都市卡若区温室及大棚栽培的番茄、辣椒和莴苣上的主要病毒有番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)、马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)及凤果花叶病毒(pepino mosaic virus,PepMV)。其中TSWV检出率最高,为45%。进一步对检出TSWV的蔬菜样品进行电子显微镜观察,发现其中含有典型的正番茄斑萎病毒属Orthotospovirus病毒粒体,应用TSWV-N基因特异性引物进行RT-PCR扩增克隆和序列分析,发现西藏昌都市卡若区蔬菜感染的TSWV与云南TSWV分离株亲缘关系最近。本研究结果明确了西藏昌都市卡若区蔬菜的主要病毒种类。综合抗体检测、病毒粒体形态观察与分类相关基因的克隆测序结果,明确了西藏昌都市卡若区蔬菜感染的主要病毒为TSWV。这也是TSWV在西藏的首次报道,为了解TSWV的发生分布及其防控提供了依据。

莴笋感染番茄斑萎病毒(TSWV)--病毒粒子分布与亚细胞病变特征

莴笋是西藏昌都市露地栽培的主要蔬菜种类之一,近年来斑萎病发生普遍,发病率达到了80%以上,引起严重的经济损失,前期研究表明发病植株受到番茄斑萎病毒(TSWV)侵染。为明确该区域莴笋感染TSWV不同时期病毒粒体分布与亚细胞病变的特征,为病毒病的精准诊断与绿色防控提供依据,本研究采集了西藏昌都市卡若区莴笋不同发病时期的样品,应用TSWV-N基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增克隆与测序分析,根据N基因序列推导N蛋白氨基酸序列比对,明确采集样品受到TSWV侵染。采集不同发病时期的样品进行负染色和超薄切片制样透射电子显微镜观察,发现早期感病叶片(症状为轻微褪绿)中病毒粒体相对含量较少,TSWV粒体分布于细胞质中,叶绿体噬锇颗粒明显增加,线粒体嵴膜部分降解,少部分细胞的液泡内有较多TSWV粒体聚集于细胞质内的囊泡中;中期感病叶片(褪绿或黄化斑)中,病毒粒体相对含量较高,较多TSWV粒体聚集于细胞质内质网池中,叶绿体膜系统降解,噬锇颗粒增加,线粒体增多;后期感病叶片(坏死斑)中,病毒粒体相对含量高,叶绿体、线粒体等细胞器降解,有大量TSWV病毒粒体聚集于残存的细胞质内囊泡中。TSWV粒体相对含量和亚细胞病变程度与植株症状严重度呈正相关,发病早期和后期TSWV粒体在细胞质内囊泡中的聚集为首次发现。上述结果为莴笋感染TSWV的早期诊断和确诊提供了新的依据,可为高原地区TSWV引起的莴笋病毒病的早期预防提供指导。

云南省马铃薯番茄斑萎病毒N蛋白自身互作功能域鉴定

为了探究番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N在马铃薯上的致病性,采用酵母双杂交和双分子荧光互补技术研究了病毒N蛋白的自身互作及其关键功能域。通过RT-PCR扩增了N基因全长及其截断突变体,并构建了酵母表达载体对其自身互作的功能区域进行鉴定。结果显示,在酵母细胞中N蛋白自身互作的关键功能域位于186位至193位氨基酸之间,且N蛋白在植物体内的互作主要发生在细胞核和细胞质中。研究结果可为番茄斑萎病毒的防控提供理论依据。

辣椒番茄斑萎病毒(TSWV)分子鉴定及环介导等温扩增(LAMP)检测技术

为明确侵染贵州辣椒的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)株系,并建立TSWV环介导等温扩增(LAMP)等快速检测技术,从贵州省辣椒主产区采集疑似感染TSWV的辣椒样本12份和西花蓟马样本10份,并应用RT-PCR、LAMP检测技术,以及基于TSWV-N基因系统发育树构建进行研究。通过分子诊断和测序结果分析,确认疑似感染辣椒样本被TSWV侵染。此外,贵州息烽地区辣椒TSWV病毒病原分离物与贵州番茄TSWV-N分离物相似度最高,为99%。基于这些发现,成功建立了针对辣椒作物和传播媒介西花蓟马的TSWV快速检测系统,为贵州辣椒病毒病害的监测和防控提供有力支持。

番茄斑萎病毒属病毒检测技术研究进展

番茄斑萎病毒属病毒属于布尼亚病毒科,是一类世界性分布、寄主范围很广的植物病毒,可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害,造成严重的经济损失。而高效的病毒鉴定或检测技术是防治病毒病害的关键基础之一。因此,本文就近年来番茄斑萎病毒属病毒鉴定与检测技术的研究进展作一综述,介绍生物学技术、电镜技术、血清学技术以及分子生物学技术在番茄斑萎病毒属病毒检测方法上的特点、发展应用方向等。

番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒在云南的发生分布研究初报

应用电子显微镜观察形态学及细胞病理特征,间接酶联免疫吸附测定(I-ELISA)和双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA),部分样品经番茄斑萎病毒(TSWV)核壳体蛋白基因(N-gene)的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,以及部分样品的生物学回接测定的方法,对采自云南不同地区20种寄主植物上204份疑似Tospovirus侵染的病株样品进行了检测。结果表明,共有20种寄主作物139份样品中含有Tospovirus分离物,从检出样品的分布看,云南全省均有分布,但在海拔2400m以上的地区其症状表现不明显。Tospovirus云南分离物在血清型、细胞病理特征以及寄主范围方面与国内外报道的同属病毒有共同的特征,同时也有较明显的差异,即云南存在有Tospovirus新的株系或种类。

番茄斑萎病毒对云南莴苣类蔬菜的侵染危害

莴苣类蔬菜是常见的食用蔬菜。近年在云南发现生菜、莴笋、油麦菜有症状表现为叶片黄化、褪绿、坏死斑的病害流行危害，为确定其病原，通过电子显微镜观察、回接试验、ELISA 检测、病毒基因分析，在典型症状病样组织粗汁液和超薄切片中均观察到有类似番茄斑萎病毒属病毒的粒体，该病毒粒体为球形，直径80-100 nm；ELISA 检测和病毒基因分析显示，侵染莴苣类蔬菜的病毒为番茄斑萎病毒。

2014年云南番茄、辣椒上番茄斑萎病毒属病毒与传毒蓟马的发生特点

【目的】了解云南地区番茄、辣椒上番茄斑萎病毒属病毒(Tospoviruses)与传毒蓟马的发生特点,为有效监测与防控Tospoviruses引起的斑萎病及传毒蓟马的发生流行提供理论指导和技术支撑。【方法】采用定点调查法,对云南Tospoviruses常发重灾区泸西和晋宁地区番茄、辣椒上的Tospoviruses及传毒蓟马的发生特点进行调查。【结果】2014年,泸西番茄、辣椒上斑萎病发病率和传毒蓟马种群数量均于7月7日达最高值,分别为16%、66%和1418、822头/100株。晋宁地区番茄、辣椒斑萎病发病较重,7月12日发病率达最高,分别为76%和80%,番茄上传毒蓟马种群数量在6月21日达最高峰,百株虫量为896头,辣椒在7月12日达最高峰,百株虫量为696头。经室内ELISA及分子检测,Tospoviruses种类鉴定为TSWV、TZSV;传毒蓟马种类鉴定为西花蓟马、花蓟马及棕榈蓟马,西花蓟马为绝对优势种。【结论】2014年云南泸西、晋宁等地番茄、辣椒上Tospoviruses引起的斑萎病及传毒蓟马危害严重,选择抗性品种是有效控制Tospoviruses发生流行的方法之一。针对Tospoviruses及传毒蓟马的发生特点,合理采用农业、生物、物理、化学防治等综合技术措施,才能保证蔬菜产业的健康发展。

北京地区发现番茄斑萎病毒

通过采用特异快速试纸条以及进一步的RT-PCR和序列测定证实,在北京局部地区的辣椒和茄子上已发生番茄斑萎病毒,这两种作物上同时发生的蓟马种类主要为西花蓟马,并且携带该病毒。番茄斑萎病毒病是极其危险的一种病害,可对作物造成毁灭性灾害。建议有关部门立即采取相应的预防与管理措施,防止其扩散蔓延。

昆明番茄斑萎病毒不同分离物N基因遗传多样性分析

2009年至2011年对昆明地区番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)发生分布进行调查,并根据保守序列设计引物扩增得到21个TSWV昆明分离物S RNA 3'-末端长861nt的核苷酸序列,该序列包括N基因部分序列(710nt)。测序分析表明,所获得的21个TSWV昆明分离物N基因序列氨基酸同源性较高(97.5%～100%);构建系统进化树,昆明21个TSWV分离物与TSWV韩国分离物(TSWV-Korea)聚为1支;而在21个分离物中,鬼针草分离物与其它分离物聚为不同分支。

番茄斑萎病毒(TSWV)广州分离物生物学特性研究

1984年南方花生病害调查,发现由番茄斑萎病毒(TSWV)引起的新病害。由于该病毒很不稳定,初步鉴定后即失活。TSWV引起花生芽枯病害在广东珠江三角洲一带很普遍。1986年调查最高发病率20%。我们自广东农科院试验地花生芽枯病株获得TSWV广州分离物,经间接酶联免疫血清试验方法鉴定。