斑马鱼神经元损伤模型在养血清脑颗粒质量控制中的应用分析

目的：探讨斑马鱼神经元损伤模型在养血清脑颗粒质量控制应用的可行性,为该制剂提供一种新型生物活性质量控制方法。方法：以养血清脑颗粒为例,采用吗替麦考酚酯诱导的斑马鱼神经元损伤药效模型对养血清脑颗粒进行神经细胞保护生物活性评价和质量稳定性检测。结果：斑马鱼神经元损伤模型作为神经细胞保护药物生物活性质控方法具有较好的精密度,日内RSD 2.2%～3.7%,日间RSD 1.2%;重复性（RSD 8.4%）和稳定性（RSD 4.9%）良好;在0.10～1.00 g·L-1内养血清脑颗粒对神经细胞保护率成良好的线性关系,方法学考察符合生物活性测定指导原则的要求。结论：采用斑马鱼神经元损伤模型评价养血清脑颗粒神经细胞保护作用的方法快速、稳定可靠,可作为现有质量控制方法的有效补充,为中药的生物活性质量控制研究提供一定的技术参考。

成年斑马鱼脊髓损伤模型的制备和评估

目的:建立一种成年斑马鱼脊髓损伤(SCI)模型。方法:将成年斑马鱼随机分为正常组、假手术组和SCI组。SCI组进行脊髓完全横断手术,假手术组对斑马鱼的脊髓只暴露而不切断,正常组不做特殊处理。通过测试处理后斑马鱼的自由游泳能力和顺行轴突追踪来评估神经再生的情况。结果:假手术组与正常组斑马鱼5 min游泳路径的平均距离比较,差异无统计学意义(P>0.05),与第1周相比,SCI组斑马鱼第6周的5 min游泳路径的平均距离显著增加(P<0.05)。顺行神经示踪显示SCI组斑马鱼在损伤后2周出现可观察的轴突恢复。结论:成年斑马鱼具有显著的SCI恢复能力,本实验建立的成年斑马鱼SCI模型技术成熟、容易复制,可应用于SCI的相关研究。

利用七氯对斑马鱼多巴胺神经元毒性影响构建帕金森病模型

目的:利用七氯对斑马鱼多巴胺神经元的影响,建立斑马鱼帕金森病(PD)模型。方法:将斑马鱼鱼卵分为正常对照组(不予干预),750μmol/L 6-羟基多巴胺(6-OHDA)组和不同浓度七氯组(1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL、10000 ng/mL),分别恒温孵育,每24 h观察胚胎发育情况并记录直到受精后120 hpf(h post fertilization,hpf),在120 hpf做行为学测定,然后实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定多巴胺通路酪氨酸羟化酶(TH2)的相对表达量。结果:与正常对照组比较,6-OHDA组幼体出现发育迟缓、脊柱弯曲,运动距离缩短(P<0.05),TH2基因表达降低(P<0.05);与正常对照组比较,1~100 ng/mL七氯组幼体发育无明显变化,但运动距离缩短(P<0.05),TH2基因表达降低(P<0.05),1000~10000 ng/mL七氯组出现色素沉着分布和脊柱弯曲,而且运动距离更短(P<0.05)、TH2基因表达更低(P<0.05),变化具有浓度依赖性;与6-OHDA组比较,1000~10000 ng/mL七氯组运动距离更短,TH2基因表达更低,其中10000 ng/mL七氯组运动距离缩短和TH2基因表达降低有统计学差异(P<0.05)。结论:传统PD模型造模药物6-OHDA和1000~10000 ng/mL七氯都可通过影响多巴胺神经元功能成功建立斑马鱼PD模型,其中10000 ng/mL七氯的造模效果比6-OHDA更显著。

斑马鱼幼鱼模型在急性肾损伤研究中的适用性

斑马鱼作为一种新兴的脊椎模式生物,近来被广泛应用于人类疾病研究。斑马鱼幼鱼前肾解剖结构简单,但在组织结构和分子水平上与哺乳动物后肾相似,并具备同样复杂的生物学功能,损伤后的病变反应与人类肾相似,同时斑马鱼幼鱼具有自身特点和优势,是进行肾发育和肾疾病研究的重要模型。本文从斑马鱼幼鱼前肾的生物学特点、幼鱼肾损伤的病变反应机制及在肾损伤研究中的应用优势3方面阐述该模型在急性肾损伤研究中的适用性。

斑马鱼肝损伤模型的研究进展

肝脏是许多药物的重要靶点,建立斑马鱼肝损伤模型,对药物引起的肝损伤进行研究,有助于筛选护肝药物。文章对斑马鱼的特点、不同药物对斑马鱼肝损伤造模原理和方法的研究进行了综述。

视神经损伤引起斑马鱼视网膜神经细胞凋亡的研究

用石蜡连续切片苏木精染色法 ,通过定量分析研究夹伤和切断视神经后 ,斑马鱼视网膜神经节细胞、视杆和视锥细胞密度的变化 .结果发现 ,在损伤视神经 7～ 2 1 d后 ,上述 3种细胞的细胞核密度均呈减少趋势 ,节细胞减少的比率大于感光细胞 ,而感光细胞中视锥细胞所受影响比视杆细胞更为明显 ;在夹伤和切断视神经两种情况中 ,后者引起视网膜神经节细胞核密度的减少更为显著 .上述结果表明 ,损伤视神经不但影响与其相连的神经节细胞 ,而且可逆向跨神经元地影响感光细胞的变化 .由上述结果推测 ,由于损伤视神经使视网膜神经节细胞失去靶组织而引起的各种神经细胞密度减少是视网膜中神经细胞凋亡的表现 .

斑马鱼心脏损伤模型的建立及桔梗提取物对其心脏损伤的干预作用研究

目的:建立阿霉素诱导的斑马鱼心脏损伤模型,观察桔梗提取物对其心脏损伤的干预作用。方法:选取受精后48 h心脏特异表达绿色荧光转基因Tg(cmlc2:EGFP)斑马鱼,随机分为正常组和阿霉素低、中、高剂量组。干预24 h后,观察各组斑马鱼生存情况,计算生存率。荧光显微镜下观察各组斑马鱼心脏相关指标,包括心脏形态、心率,测量并记录静脉窦和动脉球(SV-BA)距离。确定建立斑马鱼心脏损伤模型的阿霉素用量。另取斑马鱼随机分为正常组、模型组(阿霉素10 μmol/L)和桔梗提取物低、中、高剂量(阿霉素10 μmol/L联合20、40、80μg/mL桔梗提取物)组,分别干预24 h后,观察各组斑马鱼生存情况,计算生存率。荧光显微镜下观察各组斑马鱼心脏收缩和舒张形态,测量并计算各项心脏功能指标,包括心率、SV-BA距离、每搏输出量、心输出量。结果:阿霉素各剂量组斑马鱼生存率均为100%;与正常组比较,10 μmol/L、20 μmol/L阿霉素诱导后斑马鱼活动能力受到限制,心包出现水肿,心率下降(P<0.05),SV-BA距离增加(P<0.05)。选取10 μmol/L阿霉素建立斑马鱼心脏损伤模型。与模型组比较,中、高剂量桔梗提取物能够缓解斑马鱼心包水肿,提高心率(P<0.05),缩短SV-BA距离(P<0.05),提高每搏输出量及心输出量(P<0.05)。结论:阿霉素10 μmol/L处理24 h可成功并安全建立斑马鱼心脏损伤模型,桔梗提取物对心脏损伤斑马鱼的心脏功能具有一定的保护作用。

斑马鱼作为模式生物在脊髓损伤修复研究中的应用

脊髓损伤常常导致严重的和永久性残疾,不仅降低患者的生活质量,还给社会和家庭带来沉重的负担。脊髓损伤的修复和治疗一直是世界研究的热点和难点,如何有效地促进脊髓的修复一直是神经科学领域研究的难题。不同的物种之间再生能力差异很大。近年来,斑马鱼作为一种新兴模式生物,显示出了很大的优越性。与人和高等脊椎动物相比,斑马鱼具有非凡的组织再生能力,脊髓损伤后显示出了强大的神经修复能力,是研究脊髓损伤的理想动物模型。

基于斑马鱼模型研究抗氧化活性十肽YSQLENEFDR的抗帕金森症活性

目的基于斑马鱼帕金森症(Parkinson’s disease,PD)模型,研究一种抗氧化活性十肽YSQLENEFDR (Tyr-Ser-Gln-Leu-Glu-Asn-Glu-Phe-Asp-Arg)的抗帕金森症活性。方法实验分为空白对照组,50μmol·L-11-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-terahydropyridine,MPTP)诱导组以及50μmol·L-1MPTP和不同浓度(2、10、50 mg·L-1)的十肽共处理组。受精后4d(day post fertilization,dpf),用荧光显微镜观察并记录各实验组转基因斑马鱼多巴胺神经元和脑部血管的发育情况;5dpf时,用Zebrabox斑马鱼行为分析仪分析野生型斑马鱼行为并通过qRT-PCR检测帕金森相关基因的表达变化。结果与空白对照组相比,MPTP处理组斑马鱼出现多巴胺神经元缺失、脑部血管损伤、帕金森状行为和帕金森相关基因表达异常。与MPTP处理组比较,共处理组斑马鱼表现出多巴胺神经元缺失减少、脑部血管损伤降低、帕金森状行为缓解的表征,相关基因表达趋于正常。结论抗氧化活性十肽YSQLENEFDR具有抗帕金森症活性。

斑马鱼心脏再生模型及研究进展

心脏病作为一种发病率和死亡率很高的疾病,严重威胁人类身体健康。斑马鱼作为模式生物,其成体心脏再生功能的发现,为研究和治疗心脏疾病拓展了新的视角。本文综述了多种斑马鱼心脏损伤模型,包括心尖切除损伤、冰冻损伤以及心肌细胞遗传消融模型等;并深入探讨了心脏再生过程中的关键生物学过程,包括多种信号通路在不同细胞类型的时序性激活、心肌细胞表观遗传学编程、冠状血管新生、发育相关关键转录因子的激活以及心肌细胞肌节结构的解离和重构等。对心脏再生机制的解析有望为人类心脏疾病的治疗提供新的思路和干预策略。

斑马鱼肾损伤造模方法及评价指标的研究进展

肾容易受到体内外各种物理、化学和生物因素的影响,致使肾功能损害,造成急慢性肾疾病。预防和治疗各种因素引起的肾功能损害是泌尿系统研究的重要内容。斑马鱼幼鱼通体透明、产卵量大、易于基因编辑,在肾的形态、生理、功能等方面以及对化合物的反应也与人类具有很高的相似性,是理想的动物模型。本文将对斑马鱼肾损伤造模方法及评价指标进行综述。

脑脉泰胶囊对外周神经元损伤模型斑马鱼神经再生的影响

目的探讨脑脉泰胶囊治疗脑梗死的可能作用机制。方法脑脉泰胶囊用超纯水溶解成50、100、250、500、1000、1500μg/ml 6个浓度,均分别处理30尾野生型AB系斑马鱼24h后,统计各组斑马鱼死亡数量,绘制浓度效应曲线,并计算最大非致死浓度,筛选实验药物浓度。取受精后1天运动神经元转基因荧光斑马鱼,分为空白对照组、模型组、阳性对照组和脑脉泰胶囊高、中、低剂量组,每组30尾。除空白对照组外,其余各组斑马鱼用1.5%乙醇诱导处理斑马鱼48h建立斑马鱼外周运动神经元损伤模型。造模结束后,阳性对照组给予L-甲状腺素钠0.08μmol/L,空白对照组和模型组给予养鱼用水,脑脉泰胶囊低、中、高剂量组分别给予筛选浓度的脑脉泰胶囊处理24h。药物处理结束后,利用图像处理软件测量外周运动神经元的长度,计算促神经再生率。结果脑脉泰胶囊浓度在50、100μg/ml时,斑马鱼无死亡;浓度为250μg/ml时斑马鱼开始出现死亡,根据浓度效应曲线得出脑脉泰胶囊最大非致死浓度为170μg/ml,故本研究选取17、57、170μg/ml为脑脉泰胶囊低、中、高剂量组干预浓度。与空白对照组比较,模型组斑马鱼外周运动神经元长度显著缩短(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组和脑脉泰胶囊低、中、高剂量组斑马鱼外周运动神经元长度增加(P<0.01);与阳性对照组比较,脑脉泰胶囊中、高剂量组斑马鱼外周运动神经元长度差异无统计学意义(P>0.05),而脑脉泰胶囊低剂量组斑马鱼外周运动神经元长度降低(P<0.01)。阳性对照组和脑脉泰胶囊低、中、高组促神经再生率分别为31%、17%、29%、30%。结论脑脉泰胶囊对外周神经元具有促神经再生作用,可能为其治疗脑梗死作用机制之一。

应用核素标记相对和绝对定量技术结合纳升液-质联用筛选养血清脑颗粒对斑马鱼神经损伤预后的生物标志物

目的分析斑马鱼神经元模型损伤给药治疗前后总蛋白差异,寻找养血清脑颗粒对斑马鱼神经元损伤预后的生物标记物及其作用机制。方法采用核素标记相对和绝对定量技术结合纳升液相色谱和串联质谱(Nano LC-MS/MS)对给药前后斑马鱼药效模型总蛋白进行分离并分析肽段,采用Proteinpilot 4.2软件对蛋白进行鉴定和定量分析,对获得的差异蛋白进行生物信息学分析,应用蛋白印迹法对可能的生物标记物进行验证。结果通过Nano LC-MS/MS分析鉴定出置信度>95%的蛋白质共1 933种,其中总差异表达蛋白质130种,模型组与模型给药组表达量上调≥1.5倍的蛋白质有9种,下调≤0.70倍的蛋白质有23种。通过GO分析显示,差异蛋白的分子功能主要集中在神经元离子通道的翻译和代谢过程;Western blot结果显示,与模型组相比,差异表达蛋白Ef1-α(elongation factor 1-alpha)和α-6-F(Na^+/K^+ transporting ATPase alpha 1 polypeptide)在给药后表达量下调,差异具有统计学意义(P<0.05),且与质谱结果一致。结论 iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术能高通量地筛选斑马鱼神经元损伤相关蛋白,初步阐述养血清脑颗粒对斑马鱼神经元损伤预后的作用机制。

阿霉素诱导的斑马鱼心肌损伤模型研究

目的:建立阿霉素诱导的斑马鱼心肌损伤模型,为心血管疾病药物筛选提供模型参考。方法:取转基因(cmlc2:EGFP)系心脏特异表达绿色荧光斑马鱼培育繁殖。待斑马鱼胚胎生长36 h时,分成对照组及阿霉素低、中、高浓度组(20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml),每组40条。分别用E3胚胎培养液及相应浓度的阿霉素干预。干预24 h和48 h后,观察各组斑马鱼胚胎的生存情况,计算生存率。显微镜下观察各组斑马鱼胚胎的表型,测量并记录静脉窦和动脉球(SV-BA)之间的距离。制备冰冻切片并行HE染色,观察各组斑马鱼心脏组织的形态学变化;显微镜下解剖心脏,进行DAPI和TUNEL染色,激光共聚焦显微镜扫描观察心肌细胞的凋亡情况。结果:(1)与对照组相比,30μg/ml及40μg/ml阿霉素干预24 h、48 h后,斑马鱼胚胎生存率显著降低,且呈浓度和时间依赖性。(2)正常斑马鱼活动力强,无心包水肿;不同浓度的阿霉素干预48 h后,斑马鱼活动力受到抑制,心房、心室逐渐变大,出现不同程度的心包水肿,其中阿霉素40μg/ml组表型最为明显。(3)与对照组相比,阿霉素各浓度组斑马鱼的SV-BA距离显著增大(P<0.01),其中阿霉素40μg/ml组斑马鱼的SV-BA距离较20μg/ml组和30μg/ml组显著增大(P<0.05,P<0.01)。(4)HE染色显示,阿霉素40μg/ml组斑马鱼出现张口呼吸,心脏明显变大,心脏结构紊乱,有红细胞溢出。(5)DAPI和TUNEL染色显示,阿霉素40μg/ml组斑马鱼心脏明显变大,细胞数目减少且较稀疏,细胞核增大,凋亡细胞增多。结论:表明阿霉素诱导的斑马鱼心肌损伤模型成功建立。阿霉素对斑马鱼胚胎的心肌损伤作用呈时间和浓度依赖性,其机制可能与增加心肌细胞凋亡有关。

硫代乙酰胺诱导的斑马鱼急性肝损伤模型

目的:研究斑马鱼幼体是否适于作为药源性肝损伤的评价模型并探讨其毒理机制。方法:将发育正常的3-dpf斑马鱼幼鱼暴露于不同浓度的硫代乙酰胺溶液中72 h,显微镜下活体观察斑马鱼幼鱼给药后的畸形表型和肝脏形态的变化;通过油红O染色观察肝脏脂肪含量变化;通过组织切片和H&E染色观察幼鱼肝脏细胞结构的变化;用RT-PCR方法检测幼鱼肝脏病理标志基因和凋亡相关基因转录水平的变化。结果:活体观察显示斑马鱼幼鱼在给药后出现不同程度的畸形表型;病理学显示肝脏细胞核结构异常,细胞质出现大量脂肪空泡;油红O染色显示肝细胞有脂肪堆积;RT-PCR的结果表明硫代乙酰胺能够上调脂肪肝和肝纤维化相关基因;能够促进凋亡基因Bid和Bax-2表达,并抑制促存活基因Mcl-1b和Bcl-2的表达。结论:硫代乙酰胺对斑马鱼幼鱼肝脏产生的毒性作用与对哺乳动物肝脏的损伤相似。斑马鱼可以作为快速评价、筛选和研究药物肝脏毒性的模式动物。

江南大学医学院神经科学中心申延琴教授实验室介绍

江南大学位于美丽的太湖之滨-无锡,是一所教育部直属的211重点院校。江南大学无锡医学院成立于2012年,目前已经吸引大量海内外优秀人才加盟。医学院神经科学中心申延琴教授实验室致力于神经退行性疾病及中枢神经损伤及修复的研究。

模式生物斑马鱼在新生儿缺氧性脑损伤研究中的应用

围生期多种因素可导致胎儿或新生儿不同程度的缺氧性脑损伤,多见于围生期窒息.缺氧引起脑损伤的机制一直未能充分阐明,且目前尚无有效的药物及治疗方法改善围生期缺氧所致的脑损伤.现就近年来关于斑马鱼作为模式动物研究缺氧性脑损伤的研究进展作一综述,主要从斑马鱼缺氧性脑损伤模型的解剖学和行为学基础、建模方法、研究策略,并结合其在神经营养药物筛查方面的优势进行分析,对斑马鱼研究缺氧性脑损伤的研究前景进行了展望,为研究新生儿缺氧缺血性脑病的治疗方案提供了新思路.

基于化学成分和生物效应的栝楼桂枝汤质量评价研究

该研究采用超高效液相色谱-串联质谱的方法,分析测定栝楼桂枝汤中的24种化学成分,在此基础上,结合吗替麦考酚酯诱导的斑马鱼神经元损伤药效模型对栝楼桂枝汤进行神经保护生物活性评价,旨在探讨建立一种综合化学成分与生物效应的栝楼桂枝汤质量评价模式,研究结果表明建立的方法可行,基本稳定可靠,可为中药复方的质量控制研究提供参考。