斜纹夜蛾病毒对γ和e的响应

从存活率和自由基两个方面研究斜纹夜蛾病毒对γ和e的辐射响应。电离辐射在斜纹夜蛾病毒中产生长寿命的自由基,其浓度与辐射剂量成线性关系。存活率与辐射剂量的关系以及存活率与自由基浓度的关系都为“肩型”曲线。拟合存活率与剂量的关系曲线,得斜纹夜蛾病毒为二次击中探测器,研究剂量—自由基—存活率的关系可获得斜纹夜蛾病毒辐射损伤机制的信息以及用ESR方法代替生物方法测定斜纹夜蛾病毒感染力的可能性。

斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR检测

旨在建立一种快速、可靠的斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒(Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)的分子检测方法,以克服目前常规PCR技术很难检测到斜纹夜蛾成虫带病毒的缺陷。以SpltNPV的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,egt)基因为检测对象,基于该基因序列设计了巢式PCR引物,其中一对外侧引物egt-F/R和一对内侧引物egt1-F/R,并研究斜纹夜蛾成虫带毒的巢式PCR检测可靠性。结果表明:基于egt基因的巢式PCR方法可以特异性扩增SpltNPV的DNA,引物egt-F/R的扩增检测最低限为10-7μg/μL;且基于引物egt-F/R的两轮普通PCR无法检测出成虫带毒,而采用巢式PCR方法可有效扩增出目的egt片段,巢式PCR检测方法的灵敏度比两轮普通PCR检测方法提高2个数量级。因此,本研究成功建立了基于SpltNPV的egt基因的巢式PCR检测技术,该方法为斜纹夜蛾成虫带毒、传毒等流行病学研究提供了可靠的技术支撑。

保幼激素类似物对斜纹夜蛾核多角体病毒增殖的影响

分别用5×106,1×107,5×107,1×108PIBs/mL4种浓度的斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltNPV)感染斜纹夜蛾末龄幼虫(第6龄),并于同龄期以10μg/头的保幼激素类似物(JHA)methoprene分别对各感染组进行点滴处理,以研究JHA对SpltNPV增殖的影响。研究表明,与对照组相比各不同浓度处理组病毒总产量分别提高227.06%、128.71%、52.62%、33.15%,平均单头病毒含量分别提高49.15%、48.40%、36.40%和31.11%,病毒感染死亡率分别提高119.21%、52.72%、12.64%和1.12%。其中以1×107PIBs/mL感染再经JHA处理的病毒总产量和平均单头病毒含量最高,分别为1701.8×108PIBs和60.1×108PIBs。各处理组的病毒总产量和平均单头病毒含量均显著高于其对照组。在此基础上,进一步研究了JHA对染毒与未染毒宿主消化生理的影响。结果表明,JHA处理不仅延长了6龄幼虫的寿命,增加了其取食量,而且还显著提高了幼虫的食物转化率和病毒产量。

斜纹夜蛾核多角体病毒gp37及其邻近序列的克隆及分析

从斜纹夜蛾核多角体病毒 (Spodopteralituranucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)基因组中克隆了 gp37基因 .分子生物学软件分析表明 ,在 gp37基因内部存在糖基化位点 .含有晚期表达基因的启动子序列(ATAAG) ,推测为晚期表达的病毒膜糖蛋白基因 .通过GP37蛋白的同源性比较 ,绘制了以 gp37基因为基础的杆状病毒进化树 ,发现与以多角体蛋白基因 (polyhedrin)为基础所绘制的杆状病毒分子进化树有较大差异 .以polyhedrin基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒 (Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)与杆状病毒代表种———苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (Autographacalifornicamultinucleocapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)分开 ,根据 gp37基因分析则将二者归到同一分枝 。

斜纹夜蛾核型多角体病毒研究进展

斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)是一种世界性分布的杂食性害虫,经常暴发成灾,给农业生产带来巨大损失。斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltNPV)能有效控制斜纹夜蛾种群数量,是有效防治斜纹夜蛾的生物制剂,具有重要的经济、生态和环保价值。本文从毒力、流行病学、分子生物学、复配剂及其田间应用和对斜纹夜蛾天敌的影响等方面综述了斜纹夜蛾核型多角体病毒的研究进展。

斜纹夜蛾核型多角体病毒对宿主致死的时间和浓度效应

应用时间 -剂量 -死亡率模型研究了斜纹夜蛾核型多角体病毒对宿主种群致死的时间和浓度效应 .结果表明 ,斜纹夜蛾核型多角体病毒对斜纹夜蛾幼虫有很强的毒力 ,当饲毒在 1.12× 10 6 PIBs/ m L 以上时引起个体全部死亡 ;单独考察病毒对宿主的时间和浓度效应 ,在饲毒后的第 3天至第 15天内 ,致死中浓度 L C5 0 为 2 .5 7× 10 4～2 .17× 10 8PIBs/ m L,第 8天的 L C5 0 为 5 .95× 10 5 PIBs/ m L,在试验的病毒浓度范围内 ,致死中时间 L T5 0 为 1.3795～ 9.30 3 9d.

斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白原核表达

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化Escherichia.coliBL21(DE3),在1mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60kDa的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。

斑痣悬茧蜂和斜纹夜蛾核多角体病毒的互作及氟啶脲对寄生蜂的影响

探寻不同生物防治资源协同控制害虫的可行性，研究了斑痣悬茧蜂和斜纹夜蛾核多角体病毒（SIN．PV）联合作用于斜纹夜蛾时两者的相互影响，以及昆虫生长调节剂氟啶脲对斑痣悬茧蜂的影响。结果表明，住SIN—PV浓度为10^6PIB／ml、10^7PIB／ml和10^8PIB／ml3个浓度下，无论是病毒和寄生蜂一同处理，还是先寄生蜂处胛1d后再病毒处理，斑痣悬茧蜂对S1NPV的侵染力和侵染速度均无显著影响。联合处理时病毒对寄生蜂也无不良影响，蜂后代结茧数与对照无差异，仅缩短了先寄生蜂后10^6PIB／mlSINPV处理组寄生蜂从卯到茧的发育历期。．从氟啶脲对斑痣悬茧蜂的影响来看，寄生蜂寄生经1．25mg／L氟啶脲处理后的甜菜夜蛾，其后代发育历期和结茧均未受影响，仅羽化受影响。寄生蜂成虫直接经10mg／L、20mg／L和40mg／L（田间推荐剂量）氟啶脲处理后，均对后代结茧和发育历期等无显著影响。表明斑痣悬茧蜂可较安全地与一定浓度范围斜纹夜蛾核多角体病毒或氟啶脲耳天合用于夜蛾类害虫的控制。

保幼激素类似物对斜纹夜蛾核型多角体病毒在宿主血淋巴中增殖动态的影响

通过研究保幼激素类似物（juvenile hormone analogues，JHA）methoprene对斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SphNPV）在宿主血淋巴中增殖的影响，以探明JHA促进SphNPV增殖的初步机制，为阐明JHA促进病毒增殖提供更全面的理论依据。应用SDS—PAGE及Western blot法，分析了methoprene对SphNPV多角体蛋白（polyhedron，POLH）在宿主斜纹夜蛾6龄幼虫血淋巴中合成的影响。结果表明：经methoprene处理后2～3天可明显促进幼虫血淋巴液中POLH的合成。在此基础上，通过荧光定量PCR检测，发现methoprene对SpltNPV在幼虫血淋巴液复制的影响主要发生在处理后的第4和第5天，该期间polh基因的拷贝数比对照显著增加，拷贝数的峰值达1．22×10^10／mL。

核型多角体病毒对斜纹夜蛾酚氧化酶活性及血淋巴黑化的影响

以斜纹夜蛾核型多角体病毒（S1NPV）为免疫刺激因子，观察SlNPV对斜纹夜蛾幼虫酚氧化酶活性及其血淋巴黑化的影响。结果表明：斜纹夜蛾幼虫感毒后，其血淋巴黑化率在感毒1d后开始逐渐下降，随着感毒时间推移和幼虫日龄增大，病毒抑制其黑化作用增强；在感毒后连续5d观察时间内，感毒幼虫血淋巴黑化率始终低于健康幼虫，且在感毒4～5d后达到显著水平；感毒幼虫体内及其血淋巴酚氧化酶活性在感毒后前3d都是逐渐上升而后逐渐下降；感毒幼虫体内酚氧化酶活性在感毒后前3d高于健康幼虫，在感毒4d后开始低于健康幼虫，且在感毒2、3、5d后均达到显著水平；与健康幼虫相比，感毒幼虫血淋巴酚氧化酶活性在感毒2d后开始明显增强，但感毒5d后急剧下降。

C型斜纹夜蛾核型多角体病毒X_(17)病毒株部分基因的序列分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nucleopolyhdrovirus,SpltMNPV)X17株是采用活体克隆法自SpltMNPV日本小笠原株分离的病毒克隆。为了揭示X17病毒株基因型,根据已发表的SpltMNPVⅡ基因组全序列(GenBank登录号:NC_011616)设计引物,PCR扩增多角体蛋白基因(polh),并与SpltMNPV不同基因型及37种其他核型多角体病毒(NPV)作分子进化比较。系统发育树显示:SpltMNPV分为SpliNPV(A)型、SpltMNPV(B)型和SeMNPV(C)型3种基因型,此结果与前人利用基因组酶切图谱的研究结果一致。X17与SpltMNPV-1和SpltMNPVⅡ处于一个分支,属于SeMNPV(C)基因型,与A型和B型相距较远。此外,扩增了X17病毒基因38.7kD,Lef-1,Lef-9,fp,p10和p74,并与SpltMNPV,SpltMNPVⅡ,SeMNPV和SfNPV的同种基因进行同源性比较。结果表明,基于这6个ORF,X17与SpltMNPV同源性最低,其中Lef-9的氨基酸序列一致性最高,也仅为69%,38.7kD的氨基酸序列一致性只为26%。多数基因X17与SpltMNPVⅡ和SeMNPV的同源性较高,其中fp25K的氨基酸序列一致性最高,分别达95%和96%;但也有些基因同源性较低,如38.7kD的氨基酸序列一致性均为64%。因此,X17应是SpltMNPVC基因型的一种新毒株,命名为SpltMNPVⅡ-1。该研究为X17病毒株的进一步研究利用奠定基础。

斜纹夜蛾核多角体病毒抑制苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒诱导的斜纹夜蛾细胞凋亡

野生型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)感染斜纹夜蛾 (Spodopteralitura)细胞系Sl zsu 1,可引起典型的细胞凋亡 ;但可以在草地夜蛾 (Spodopterafrugiperda)细胞Sf 9中复制并形成多角体 .比较了AcMNPV p35基因在病毒感染两种细胞的复制和转录情况 ,认为 p35在非受纳细胞中及时有效的表达能阻止细胞发生凋亡 ;共感染实验结果表明 ,斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)可以抑制AcMNPV诱导的细胞凋亡并可帮助病毒进行复制 ,推测SpltMNPV基因组中与 p35同源的 p4

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株ORF63基因的序列特征及表达与启动子活性分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(SpltMNPVⅡ)分离株是繁殖率和毒力极强的新型病毒株,ORF63是该病毒分离株的一个功能未知基因。从SpltMNPVⅡ分离株基因组中克隆了ORF63。序列分析表明,该基因读码框为1 071 bp,编码356个氨基酸,蛋白质分子质量为41.3 kD;起始密码子ATG上游存在一个早期和晚期启动子基序,编码蛋白序列含有CNX、MutH等多种结构域。启动子活性和转录时相分析表明ORF63是一个早、晚期表达的基因,在病毒感染4 h和18 h时有2个转录峰,24 h以后转录水平略有下降,但总体趋于稳定。构建该基因的原核表达载体pET-28a-ORF63,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体,Western blot检测制备的多克隆抗体特异性较好,效价可达1∶3 200以上。由以上结果推测,SpltMNPVⅡ分离株的ORF63基因是一个早期和晚期均有表达的病毒基因,可能与SpltMNPVⅡ感染宿主细胞后自身DNA的复制有关,参与早期芽生病毒(BV)的发生和晚期包涵体衍生病毒(ODV)的成熟2个过程。

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型同源重复区的增强子功能分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(SpltNPVⅡ)基因组DNA含有7个同源重复区(hr)。采用脂质体介导转染法和瞬时表达实验对7个hr在异源病毒感染的BmN和Sf21细胞中增强异源ie1启动子转录活性的功能进行分析。结果表明,除hr5外,SpltNPVⅡhr均能增强BmNPV ie1启动子的转录活性,其中hr1、hr4和hr7增强效率较高,为对照的30~40倍;7个hr均能显著增强AcMNPV ie1启动子的转录活性,其中hr7增强效率高达1 246倍,其余增强效率在17~538倍之间。另外,SpltNPVⅡhr增强异源ie1启动子转录活性的效率与其所含的正反向重复序列、回文序列以及与复制相关的基序等特征结构的数目存在显著的正相关。

斜纹夜蛾核型多角体病毒不同分离株基因序列的同源性分析

研究SpltMNPV不同分离株及SpltMNPV分离株与SpliNPV间基因序列的同源性,为SpltMNPV分离株的利用提供理论基础。根据已发表的斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)中国株(Zh)基因组全序列(AF527603)和海灰翅夜蛾核型多角体病毒(SpliNPV)NotI-D片段序列(AF527603)设计引物,PCR方法扩增得到SpltMNPV日本福冈株(Fu)、埃及株(Eg)和小笠原株(Og)的ORF39～ORF42和ORF119～ORF124编码区全序列。SpltMNPV不同分离株及SpltMNPV分离株与SpliNPV间基因序列的相似性比较,Zh株和Og株,Eg株、Fu株和SpliNPV的相似性高,而Zh株和Eg株、Fu株或SpliNPV,Og株和Eg株、Fu株或SpliNPV的相似性都比较低。亦即SpltMNPV3种基因型,B型和C型的同源性高,A型与B型或C型的同源性比较低,但A型与SpliNPV的同源性高;同一基因型内不同分离株(Eg株和Fu株)的同源性高。ETG分子进化分析表明Eg株、Fu株和SpliNPV处于一个分支,而Eg株、Fu株和SpliNPV与Zh株和Og株则处于不同的分支。因此推断Eg株和Fu株为SpliNPV的分离株,而Og株为SpltMNPV的分离株。

斜纹夜蛾核型多角体病毒DNA诱导同源昆虫细胞的凋亡

发现野生型斜纹夜蛾核型多角体病毒 (Spodopteralituranuclearpolyhedrosisvirus ,SpltNPV)DNA转染SL 1细胞能诱导细胞凋亡 .SpltNPV DNA转染其同源细胞系斜纹夜蛾核SL 1细胞 6h后 ,光镜下即可见细胞膜表面突出或形成小泡 ,细胞碎裂成凋亡小体 ,18h后 ,细胞 10 0 %碎裂成凋亡小体 .DAPI荧光染色显示感染细胞核渐呈半月形 ,直至碎裂被凋亡小体包裹 .被转染的SL 1细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈典型梯形谱带 .野生型SpltNPV病毒粒子感染的SL 1细胞既无多角体的出现 ,也无凋亡现象的发生 .

斜纹夜蛾核型多角体病毒DNA解旋酶序列比较分析

根据斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)基因组全序列设计引物,PCR扩增A6、X8、X15和X17的DNA解旋酶(Helicase)基因,并将得到的序列与SpltNPV及其他核型多角体病毒的helicase基因进行同源性比较和分子进化分析。结果表明,A6、X8和X15与SpltNPV同源性较高,核苷酸序列相似性分别为89%、89%和91%,氨基酸序列相似性均为93%;X17与SpltNPV2和甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodopteraexguia NPV,SeNPV)同源性高,核苷酸序列相似性分别是90%和82%,氨基酸序列相似性分别为92%和83%;而SpltNPV、A6、X8、X15与X17、SpltNPV2、SeNPV的同源性较低,核苷酸序列相似性为52%～54%,氨基酸序列相似性为41%～43%。分子进化分析发现,供试斜纹夜蛾核型多角体病毒分为2组:X17、SpltNPV2、SeNPV处在一个分支,而A6、X8、X15、SpltNPV处在另外一个分支。

斜纹夜蛾多角体病毒包埋型病毒受体的鉴定

蔗糖密度梯度离心法提纯斜纹夜蛾核多角体病毒（＄Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｄｒｏｖｉｒｕｓ， ＳｐｌｔＭＮＰＶ）包埋型病毒粒子（ｐｏｌｙｈｅｄｒａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＰＤＶ），以此病毒粒子作抗原，免疫家兔获得抗血清；用ＳＤＳ裂解缓冲液提取斜纹夜蛾幼虫中肠组织细胞总蛋白。采用病毒铺覆蛋白印迹技术（ＶＯＰＢＡ），利用抗ＰＶＤ抗血清对病毒受体进行检测，结果表明斜纹夜蛾中肠细胞总蛋白中４０ｋＤ、７３ｋＤ、８５ｋＤ的三种蛋白能够结合ＰＤＶ。

斜纹夜蛾核多角体病毒诱导甜菜夜蛾细胞凋亡的研究

斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multiple nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)不能成功感染亲缘关系相近的甜菜夜蛾Spodoptera exigua,为了探究其中原因,取SpltMNPV感染甜菜夜蛾离体细胞Se301,利用光学显微镜,电子显微镜以及DAPI(4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)荧光染色等方法对其进行检测。结果显示Se301细胞被SpltMNPV感染后出现早期凋亡特征,但未进行至细胞凋亡晚期形成凋亡小体;病毒感染受到阻碍,始终没有病毒多角体和有感染性的芽生型子代病毒产生;综合以上结果说明早期细胞凋亡仍然是限制病毒完成复制周期的重要因素。