甲醛致斜纹夜蛾SL-1细胞DNA损伤作用的研究

为了研究甲醛致昆虫细胞DNA-蛋白质的交联作用(DNA-protein crosslinks,DPC)和DNA的断裂作用,以斜纹夜蛾SL-1细胞为材料,采用KCl-SDS沉淀法和彗星实验来检测液态甲醛染毒后SL-1细胞中DPC的含量及DNA的断裂效应.KCl-SDS沉淀法的结果表明,低浓度的液态甲醛(25μmol/L,125μmol/L)不能引起DPC,较高浓度(625μmol/L)可以引起明显的DPC(P<0.01);而彗星实验的结果则显示甲醛在低浓度(5μmol/L,25μmol/L)时可以引起DNA链的断裂(P<0.01),在较高浓度(625μmol/L)时尾部DNA%和尾矩比空白对照显著降低(P<0.01),表明此时甲醛所致的DPC掩盖了DNA断裂的作用.结论是甲醛在较高浓度时可以导致明显的DPC作用,而在低浓度时以DNA断裂为主.

绿僵菌素A和B对斜纹夜蛾SL-1细胞的增殖抑制和致凋亡作用

绿僵菌素A和B是生物活性分子,本研究用MTT法、相差显微观察、荧光倒置显微观察和流式细胞术比较了绿僵菌素A和B对斜纹夜蛾Spodoptera litura SL-1细胞的毒杀作用。结果表明:绿僵菌素A和B对SL-1细胞均具有明显的增殖抑制作用,且具有正比的时间-浓度-效应关系,绿僵菌素A和B处理细胞48h后的IC50值分别为7.80和20.73μg/mL。倒置相差显微观察发现,绿僵菌素A和B可以引起SL-1细胞变圆、胞膜收缩、有凋亡小颗粒形成。随着时间的延长,细胞悬浮致死并出现大量空泡和胞质外泄现象。但是在同样的处理浓度下,绿僵菌素A的作用较绿僵菌素B明显。用AO/EB染色后,荧光显微观察发现:绿僵菌素A诱导的细胞荧光强度高于绿僵菌素B。流式细胞仪检测结果表明:绿僵菌素A和B对SL-1细胞具有明显的致凋亡作用。10μg/mL绿僵菌素A和B作用细胞48h后,SL-1细胞的总凋亡率分别达78.88%±0.97%和72.23%±2.29%。本研究从细胞水平肯定了绿僵菌素具有良好的增殖抑制和致凋亡作用,并且为它在害虫防治中的潜在应用提供了一些理论支持。

乙醇提取物对斜纹夜蛾细胞Sl-1的细胞毒性比较

用MTT法测定20种泰国植物乙醇提取物对斜纹夜蛾(Spodoptera litura)卵巢细胞系Sl-1的增殖抑制作用,用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,用流式细胞术测定细胞线粒体膜电位变化。结果表明:5种植物(姜(Zingiber officinale Roscoe)、高良姜(Alpinia galangl(L.)Willd.)、印楝泰国变种(Azadirachta indica A.Juss var.siamensis Valeton)、姜黄(Curcuma longa Dennst)、泰国青柠(Citrus hystrix DC))乙醇提取物的细胞增殖抑制效果较好,抑制率明显大于阳性对照鱼藤酮,并且与提取物浓度成剂量依赖关系。不同提取物处理24h细胞形态发生明显改变,包括细胞贴壁性减弱、空泡化、细胞碎片产生;48h后细胞形态变化加强、空泡化严重、细胞碎片增多。5种植物提取物对细胞线粒体膜电位均有影响,其中印楝泰国变种、泰国青柠效果最好。初步认为姜、高良姜、印楝泰国变种、姜黄、泰国青柠对Sl-1有细胞毒性作用,值得进一步研究。

植物源物质诱导的斜纹夜蛾细胞凋亡

为了研究植物源物质对斜纹夜蛾Spodoptera litura离体培养细胞系SL-1的凋亡诱导作用,采用倒置相差显微镜观察了印楝素、喜树碱等9种物质各自对SL-1凋亡小体的浓度效应及时序性。结果表明：印楝素0.1～5.0μg/mL和喜树碱0.5～20.0μmol/L处理SL-1,24～48h后均产生大量典型的凋亡小体;茶皂素、蓖麻碱、黄樟油、丹皮酚、烟碱、苦参碱和博落回碱0.1～20.0μg/mL处理SL-1后,整个观察期72h内均无明显凋亡小体出现,凋亡诱导作用不明显。印楝素0.75μg/mL诱导SL-1细胞凋亡,从凋亡小体判断,处理后0～36h属细胞凋亡早期,36～60h属细胞凋亡中期,60h后为细胞凋亡晚期。喜树碱5.0μmol/L诱导SL-1细胞凋亡,处理后0～24h属细胞凋亡前期,24～54h属细胞凋亡中期,54h后进入细胞凋亡晚期。初步认为印楝素和喜树碱对SL-1有凋亡诱导作用,并具有一定的浓度依赖性和时序性。

杆状病毒反式激活蛋白IE-1诱导昆虫细胞凋亡及几种抑制剂对AcNPV诱导细胞凋亡的影响

为了探讨杆状病毒诱导细胞凋亡的机制 ,用含AcNPV - ie- 1基因的重组质粒 pGAM -ie- 1转染斜纹夜蛾细胞SL - 1和粉纹夜蛾细胞Tn - 5B1。转染后 2 4h通过光镜观察、DAPI荧光染料染色、DNA琼脂糖凝胶电泳等发现 ,SL - 1发生了典型的凋亡 ,而同样的现象并没有在Tn - 5B1细胞中出现。利用放线菌酮 (cycloheximide,CHX)、莫能菌素 (Monensin)及蚜栖菌素 (aphidicolin)处理AcNPV感染的SL - 1细胞 ,发现细胞凋亡被莫能菌素及蚜栖菌素抑制 ,被放线菌酮推迟。此结果为进一步研究杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡的机制等奠定了基础。

斜纹夜蛾铁硫亚基蛋白的表达及功能鉴定

铁硫亚基蛋白(rieske iron-sulfur protein,RISP)是线粒体复合物Ⅲ的关键蛋白亚基之一,在呼吸链电子传递过程中起到重要作用。本研究通过RT-PCR克隆得到斜纹夜蛾Spodoptera litura RISP基因SlitRISP的ORF,构建了pET32a-SlitRISP原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,SlitRISP原核表达蛋白以包涵体的形式存在于菌体沉淀中,且RISP抗体可成功用于该蛋白的免疫印迹检测。为了进一步鉴定SlitRISP在斜纹夜蛾离体细胞系SL-1中的功能,通过向细胞内转染siRNA,利用RNAi技术沉默SL-1中的SlitRISP。qRT-PCR结果表明,分别经50nmol/L和100nmol/L siRNA处理48h后,SL-1中SlitRISP的表达均几乎完全被抑制;Western blot结果显示,SL-1中SlitRISP含量显著低于CK。当SL-1SlitRISP被成功沉默后,通过检测SL-1线粒体膜电位、细胞ATP含量和细胞增殖抑制率鉴定RISP在线粒体电子传递过程中的重要作用。流式细胞仪测定结果表明,经50nmol/L和100nmol/LsiRNA处理24h后,SL-1线粒体膜电位相对于CK分别降低23.52%和11.32%,而处理48h后,SL-1线粒体膜电位则分别升高5.58%和27.66%;siRNA处理24h和48h后,SL-1ATP含量相对于CK分别降低82.71%和84.50%,最终导致SL-1细胞增殖抑制率分别为53.64%和67.94%。这些结果表明SlitRISP在SL-1中参与线粒体膜电位的形成和细胞ATP的合成。介于RISP在线粒体电子传递链中的重要作用,其可能成为新型杀虫作用靶标,这可为研制新型呼吸抑制剂提供参考。