断裂型内含肽在蛋白生产和生物工程中的应用

蛋白反式剪接是蛋白翻译后修饰的一种特殊机制,这一反应由断裂型内含肽自我催化完成,不需要酶和其他因子参与。与常规顺式的蛋白剪接不同的是,反式剪接是基于断裂型内含肽由N端和C端这两段多肽的高亲和力,精准地构建成一个具有剪接活性的内含肽蛋白质。反式剪接已被发展成新的生物技术应用于生产环化蛋白、构建蛋白定点与定时表达的载体和转基因植物,以及改造cDNA文库技术等。

断裂型内含肽Npu DnaE的C端序列赖氨酸突变对其剪接活性的影响

断裂型内含肽Nostoc punctiforme(Npu)DnaE作为一种为构建抗体-药物偶联物(ADC)过程中实现定点偶联的工具,其C端序列中的赖氨酸对其剪接活性有较大影响。该研究对断裂型内含肽Npu DnaE C端序列中的赖氨酸进行定点突变,得到了5种氨基酸(精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸)取代的多肽序列,以探究不同氨基酸取代对其剪接活性的影响。结果显示分别由精氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸3种氨基酸取代赖氨酸的内含肽C端序列保持了剪接活性,其中精氨酸取代的内含肽C端序列剪接效率较高。采用精氨酸取代的内含肽C端序列制备了ADC HER2-Lc-SMCCDM1,经检测其保有抗原亲和力和抗肿瘤活性。该研究结果为ADC的定点偶联和基于内含肽设计、改造蛋白质或多肽连接合成相关研究提供了技术支撑。

基于GEM展示技术内含肽介导的犬α干扰素快速纯化系统的建立

本研究分别构建含有断裂型内含肽(inteins)C端与犬α干扰素融合基因(C*-CaIFN-α)、断裂型内含肽N端与锚钩蛋白(protein anchor,PA)融合基因(NC1A-PA3)的重组表达质粒,利用IPTG诱导表达。通过GEM颗粒(gam-positive baterial enhancermatrixparticles)与PA3之间的特异性结合,将NC1A-PA3蛋白捕获到GEM颗粒上,再利用内含肽的N端与C端的结合,获得GEM-PA3-NC1A-C*-CaIFN-α。在DTT或EDTA存在情况下,内含肽C末端自我剪切,获得纯化的犬α干扰素重组蛋白CaIFN-α。通过微量细胞病变抑制方法测定CaIFN-α蛋白的活性。结果表明,两种重组蛋白均有可溶形式表达,GEM/inteins纯化系统效果良好;纯化的犬α干扰素CaIFN-α对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的抗病毒活性为3.0×106U/mL。本研究建立的基于GEM展示平台的蛋白纯化系统,将非层析标签与断裂内含肽系统相结合,为快速有效地纯化重组蛋白提供了一种方法。