斯氏副柔线虫rDNA-ITS片段的克隆及序列分析

运用PCR方法以保守引物NC5、NC13、NC13r和NC2扩增从内蒙古地区骆驼皱胃分离的3条斯氏副柔线虫（Parabronema skrjabini）rDNA的内转录间隔区1（ITS1）、5.8S序列和内转录间隔区2（ITS2）。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGM-T载体，用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明线虫1（P.sk1）扩增的ITS片段大小为837 bp，包含部分的18S、28S及全部的ITS1（298 bp）、5.8S（157 bp）及ITS2（281 bp）序列；线虫2（P.sk2）扩增的ITS1片段大小为372 bp，包含部分的18S、5.8S及全部的ITS1（296 bp）；线虫3（P.sk3）扩增的ITS2片段大小为484 bp，包含部分的5.8S、28S及全部的ITS2（284 bp）序列。同其它属线虫同源性比较ITS2序列同源性在30.2%-60.1%。本研究系首次报道骆驼斯氏副柔线虫的ITS序列，为斯氏副柔线虫分子生物学的进一步研究奠定基础。

阿拉善双峰驼斯氏副柔线虫感染情况及病理组织学变化

2009年-2010年,对不同性别、不同年龄的76峰阿拉善双峰驼斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)感染情况和病理变化进行了研究。结果显示,被调查的76峰阿拉善双峰驼中有66峰感染斯氏副柔线虫感染率高达86.9%,最大感染强度为995条/峰。大量感染虫体的骆驼真胃组织有许多淋巴细胞浸润,并有代替正常组织细胞的现象,真胃於血明显。调查提示阿拉善双峰驼斯氏副柔线虫感染严重,对养驼业有较大危害,应对其加强防治和研究。

内蒙古地区骆驼斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)病调查

本文报告了对内蒙古地区4个骆驼主产区不同品种、年龄、体质骆驼的斯氏副柔线虫(Parabromemaskr jabini)病流行病学调查结果。共剖检骆驼30只,结果表明骆驼对斯氏副柔线虫的感染率为100%,最高感染强度为7611条。证实斯氏副柔线虫是引起骆驼拉稀的主要原因,并提出了防制建议。

角蝇各龄期幼虫体内斯氏副柔线虫的分子生物学鉴定

确定角蝇各龄期幼虫体内的斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)幼虫。通过大量剖检角蝇各龄期幼虫,收集其体内的线虫幼虫,经扩增测序获得ITS基因序列,利用DNAStar 5.0软件,将其与斯氏副柔线虫成虫的ITS基因序列进行同源性比较。结果表明,角蝇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期幼虫体内的线虫幼虫确为斯氏副柔线虫幼虫。该研究结果不但为鉴定角蝇各龄期幼虫体内的斯氏副柔线虫幼虫提供了简易准确的方法,而且也为弄清斯氏副柔线虫在其传播媒介角蝇体内的发育过程奠定了基础。

不同发育阶段斯氏副柔线虫比较转录组学分析

【目的】探明不同发育阶段骆驼斯氏副柔线虫的转录组差异,了解不同发育阶段虫体在功能分类和代谢通路等方面的生物学特征,挖掘生长发育相关功能基因,丰富寄生性线虫转录组学信息。【方法】采用Illumina Hi Seq2000TM高通量测序技术对斯氏副柔线虫虫卵、第三期幼虫和雌虫进行转录组测序,构建3个样本的c DNA文库,评估建库质量;利用Trinity软件对所得序列进行De novo组装及组装效率评估;之后对获得的有效序列进行功能注释及相关生物信息学分析。【结果】测序及组装后虫卵、第三期幼虫和雌虫分别获得47 717、76 342和54 624个Unigenes,在虫卵和第三期幼虫比对中共有33 579个差异表达基因,其中表达上调的基因有20 477个,表达下调的基因有13 102个;在雌虫和第三期幼虫比对中共有32 199个差异表达基因,其中表达上调的基因有9 293个,表达下调的基因有22 906个。将成对比较的差异表达基因分别进行GO功能分类,其中虫卵和第三期幼虫比对中有6 617、3 891和8 755个Unigenes,雌虫和第三期幼虫比对中有7 043、3 686和10 177个Unigenes分别注释到生物过程、细胞组成和分子功能三大类中;通过KEGG pathway数据库分析,虫卵和第三期幼虫比对中有6 521个差异表达基因参与到251条通路中,显著富集MAPK信号通路、Wnt信号通路和氧化磷酸化等通路,雌虫和第三期幼虫比对中有6 528个参与到251条通路中,显著富集新陈代谢通路、DNA复制和细胞周期等通路。差异表达基因功能聚类分析中,雌虫和虫卵在调控生长速率和生殖发育等方面高表达;第三期幼虫在防御机制和糖类代谢等方面高表达;且3个发育阶段均在胚胎发育,胚后发育中富集高表达,其中在胚胎发育和胚后发育中分别有242和202个相关功能基因在3个发育阶段都表达,这些基因可能在胚胎(后)发育过程中起核心作用。此外,获得了9种异时性基因(如:LIN-28、LIN-14和RHEB-1等)、48个核激素受体(NHRs),包括NHR-49,NHR-48,NHR-40,NHR-1等以及36个锌金属蛋白酶(NAS),包括NAS-36、NAS-33和NAS-14等,并对其在斯氏副柔线虫虫卵、第三期幼虫和雌虫中的富集程度进行分析,发现这些基因在维持线虫正常生长发育过程中发挥关键作用,【结论】利用RNA-seq技术对3个发育阶段的斯氏副柔线虫进行测序和生物信息学分析,研究了不同发育阶段虫体的差异表达基因在GO功能分类、KEGG代谢通路和基因功能聚类等方面的生物学特性,筛选出多种异时性基因和发育相关重要基因,为后续开展斯氏副柔线虫功能基因组学研究,虫体与宿主互作、致病机制、免疫逃避等研究提供了理论依据。

斯氏副柔线虫CAMK/TSSK蛋白激酶基因的克隆及其蛋白质结构与抗原表位预测分析

为分析并预测斯氏副柔线虫免疫相关基因CTPK编码蛋白结构、功能以及其作为疫苗候选抗原的可能性,通过提取斯氏副柔线虫组织RNA,反转录合成cDNA,设计特异性引物以扩增CTPK基因的CDS区,并利用生物信息学软件对CTPK进行蛋白质结构分析和抗原表位预测。生物信息学分析表明,CTPK基因cDNA序列全长共519bp,具有完整的开放阅读框(519bp),编码173个氨基酸,相对分子质量和等电点大小分别为20.264ku和9.53。结构分析发现,蛋白质无跨膜区,无规则卷曲构成二级结构的主要组分,亲水性氨基酸比例超过60%;抗原表位预测表明,CTPK蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,既含有较多潜在的B细胞抗原表位又存在较多的T细胞抗原表位。推测CTPK有望用作斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原,本研究为骆驼斯氏副柔线虫生前诊断方法iELISA的建立和DNA疫苗的研究奠定了理论基础。

斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因的克隆及原核表达

为了筛选斯氏副柔线虫抗原基因用于血清学诊断和免疫防治研究,对斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因序列进行了生物信息学分析,RT-PCR扩增获得了Pj-CPR基因,构建重组表达质粒pETCPR后,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中并诱导表达获得重组蛋白rCPR。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rCPR大小为17.6ku,主要以包涵体的形式表达,能与感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中IgG特异性结合,具有良好的抗原活性,可用于斯氏副柔线虫病血清学诊断方法和免疫防控研究。

骆驼斯氏副柔线虫病间接ELISA检测方法的建立

为建立骆驼斯氏副柔线虫病间接ELISA(iELISA)诊断方法,本试验对骆驼斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶CPR基因进行重组表达,将获取的重组蛋白(rCPR)进行纯化和Western blotting检测,然后以纯化好的重组蛋白为抗原,通过棋盘滴定试验优化了抗原包被浓度、包被条件、抗体稀释度、酶标二抗稀释度、封闭液和封闭时间等,建立了骆驼斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法,并对建立的iELISA检测方法进行了重复性、敏感性、特异性试验和临床检测。结果显示,抗原最佳包被浓度为8μg/孔,血清最佳稀释度为1∶50,酶标二抗最佳稀释度为1∶5 000,最佳包被条件为4℃包被过夜,最佳封闭条件为3%BSA封闭2 h。临界值为0.235,待检血清D450 nm值>0.235则确定为阳性。重复性试验中变异系数均<10%,重复性较好;用该方法检测阳性血清的敏感性为96.3%;此方法仅与骆驼斯氏副柔线虫病阳性血清发生特异性反应,与感染了其他寄生虫的阳性血清无交叉反应,特异性为100%;对140份临床血清进行检测,阳性率为86.4%。综上可知,本试验成功建立了一种快速有效诊断骆驼斯氏副柔线虫病的iELISA方法。

斯氏副柔线虫GP基因的克隆、抗原表位预测及生物信息学分析

试验旨在克隆斯氏副柔线虫糖蛋白(glycoprotein,GP)抗原基因,并对其进行生物信息学分析。提取斯氏副柔线虫组织RNA,反转录合成cDNA,设计特异性引物以扩增GP基因CDS区,同时将其插入到克隆载体pMD19-T后测序,并对该基因编码蛋白的抗原表位、理化性质、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学预测。结果表明,GP基因开放阅读框(ORF)全长1 149bp,编码382个氨基酸,其分子式为C1760H2878N458O590S1760,理论分子质量约为40.15ku,等电点为4.37,无信号肽,总平均亲水性为0.032,不稳定系数为42.43,是疏水、不稳定蛋白;其磷酸化位点分布位于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上;二级结构分析显示,斯氏副柔线虫GP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主,与三级结构预测结果一致;抗原表位预测表明,GP蛋白可能有6个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位,有望用作免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。本研究成功克隆了斯氏副柔线虫GP基因,同时进行了系统的生物信息学分析和抗原表位预测,为斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法的建立和DNA疫苗的研究提供理论依据。

骆驼斯氏副柔线虫NCC基因原核表达载体的构建及生物信息学分析

本试验旨在构建原核表达载体pET30a(+)-NCC,对斯氏副柔线虫NCC基因特性进行生物信息学分析。应用RT-PCR技术扩增斯氏副柔线虫NCC基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),利用生物信息学软件对序列结构与抗原表位进行分析。结果显示,NCC基因全长711bp,编码237个氨基酸,蛋白质理论大小值为25.252ku,理论等电点为6.33,蛋白质不稳定指数为40.08;跨膜结构和信号肽分析表明NCC蛋白存在1个跨膜区,无信号肽区域,其磷酸化位点分布位于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上。NCC蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,既含有较多潜在的B细胞抗原表位又存在较多的T细胞抗原表位,本试验为斯氏副柔线虫诊断方法的建立及免疫防控提供参考。

内蒙古双峰驼斯氏副柔线虫病的流行病学调查

在2009-2011年,利用剖检法和病理组织切片技术,对内蒙古5个地区的152峰双峰驼进行了斯氏副柔线虫病的流行病学调查和病理学研究。结果显示,在被调查的152峰双峰驼中有117峰感染了斯氏副柔线虫,感染率为77.0%,最高感染强度为1 315条,骆驼真胃内斯氏副柔线虫的雌、雄虫比例在3.9∶1～1.2∶1之间;患驼的肉眼病变率为42.7%,大量感染斯氏副柔线虫的骆驼真胃黏膜有溃疡、脱落、淤血、出血,组织腺泡上皮细胞浓缩、变性,淋巴细胞异常增生。调查证实,斯氏副柔线虫病对内蒙古养驼业危害严重,应加强防治。

骆驼斯氏副柔线虫转录组的高通量测序及分析

为了系统了解斯氏副柔线虫的转录组特征并构建其转录组图谱,以不同发育阶段的斯氏副柔线虫为研究对象,应用Illumina Nextseq 500高通量测序技术平台对其进行转录组测序及生物信息学分析,结果每个样本均得到3GB的原始数据,经质量控制和拼接组装后,共获得128 454个Unigene,序列片段的平均长度与N50值分别为634和1 037bp;将Unigenes与COG,Nr,Trembl等数据库进行比对,结果表明有35 324个Unigene比对到COG数据库,根据蛋白种类大致分为25类;通过GO功能分类,5 227个Unigene映射到GO不同的功能节点上;通过KEGG pathways分析,共有13 424个Unigene参与了8 155个代谢通路。该研究结果为斯氏副柔线虫病的基础理论、诊断方法及防治研究奠定基础。

骆驼斯氏副柔线虫病传播媒介的筛选与确定

对从内蒙古骆驼生活环境中采集到的24种蝇进行普通生物学剖检,并进一步用斯氏副柔线虫特异性引物ST1、ST2对蝇体内检获的幼虫进行分子生物学鉴定,以筛选与确定骆驼斯氏副柔线虫病的传播媒介。结果显示,在西方角蝇和截脉角蝇体内均发现了疑似斯氏副柔线虫幼虫,感染强度为1～22条/个,雌蝇与雄蝇感染强度差异不显著;幼虫长度为1.033～1.934mm;雄蝇的感染率为43.8%～48.0%,雌蝇的感染率为35.7%～46.2%。扩增得到的部分ITS序列(包括5.8S)与GenBank中登录的斯氏副柔线虫ITS序列同源性高达99.3%。基本确定了西方角蝇和截脉角蝇为斯氏副柔线虫病的传播媒介。

骆驼斯氏副柔线虫雌虫和雄虫比较转录组学分析

为探明骆驼斯氏副柔线虫雌虫和雄虫的转录组差异,挖掘出与性别决定相关的功能基因,采用Illumina HiSeqTM2000分别对其雌虫和雄虫样本进行转录组测序,构建cDNA文库,通过建库质量评估和组装效率评估后对其进行功能注释及相关生物信息学分析。结果显示,比较雌虫和雄虫的转录本,获得6 430个差异表达基因,其中2 131个基因上调;4 299个基因下调。对差异表达基因进行GO功能分类,有341 328和714个Unigenes分别注释到生物学过程、细胞组成和分子功能三大类41个分支中。KEGG数据库分析,有1 116个差异表达基因参与到198条KEGG通路中,显著富集在机体免疫调节,卵母细胞成熟等通路。功能聚类分析中,雌虫样本在生殖发育、产卵、生殖行为中高表达;雄虫在主要精子蛋白、丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶中高表达。此外,在雄虫和雌虫中筛选出Tab-3,Tab-5、Fem-1和Mog-3等10种线虫性别决定相关基因,以及8种雄性性别特异表达基因和4种雌性性别特异表达基因,这些基因在虫体性别决定和性别特异性表达中发挥重要作用。本研究利用生物信息学技术预测出雌虫和雄虫差异表达基因在功能分类和代谢通路等方面的生物学特征,挖掘出性别决定基因和性别特异性表达相关基因,为进一步开展斯氏副柔线虫的功能基因组学研究、药物靶点预测和疫苗候选基因筛选提供有价值的数据资源。

斯氏副柔线虫线粒体CO1基因的克隆与序列分析

为研究斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)种间遗传标记特点,从内蒙古地区骆驼皱胃中采集斯氏副柔线虫成虫,提取虫体DNA,利用线虫通用引物扩增细胞色素氧化酶1(CO1)基因,将其克隆到pMD19-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落并进行测序,运用DNAStar 5.0和MEGA 4.0软件将测序结果与GenBank公布的相关线虫CO1序列进行比对分析。结果显示:斯氏副柔线虫DNA扩增出的CO1基因序列片段长度为689 bp。同其他相关属线虫CO1基因序列比对,斯氏副柔线虫与小口柔线虫(Habronema microstoma)、蝇柔线虫(Habronema muscae)的同源性最高,为86.7%,遗传距离为0.143;与加利西亚光丝虫(Litomosoides galizai)的同源性最低,为80.1%,遗传距离为0.229。通过两种不同方法建立的系统发育树比较,证实斯氏副柔线虫与柔线属线虫均位于同一分支,自展值都在47%以上。表明CO1基因不仅可以作为斯氏副柔线虫理想的种间遗传标记,也可为该线虫进一步的分子分类学研究提供重要基础。

斯氏副柔线虫免疫相关基因CSY原核表达载体的构建及生物信息学分析

采用RT-PCR克隆斯氏副柔线虫CSY基因的CDS区,限制性内切酶对目的片段与pET30a（＋）原核表达载体进行双酶切,构建重组表达载体,利用生物信息学软件对该基因理化性质、结构特点进行分析。结果显示：CSY基因全长774bp,编码255个氨基酸,蛋白质理论大小值为29 240,理论等电点为7.53,蛋白质不稳定指数为40.09;跨膜结构和信号肽分析表明CSY蛋白无跨膜区,无信号肽区域。结果表明：成功构建了pET-30a（＋）-CSY重组表达载体;生物信息学分析表明CSY蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,可能有7个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位,有望用于斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。

阿拉善右旗骆驼寄生虫调查报告

阿拉善右旗是一个牧业旗,是甘肃主要养驼区之一。根据一九七三年六月统计,全旗共有骆驼32,161峰,在畜牧业中占全旗人牲畜总头数的87％强,占全旗大小牲畜总头数的15.37％。而骆驼的寄生虫,至今尚缺乏调查资料。在毛主席革命路线的指引下,在批林整风运动的推动下.阿拉善右旗畜牧业生产战胜了连续三年的严重旱灾,骆驼峰数仍有增长。

内蒙古地区骆驼生活环境蝇种调查探究

目的了解草原地区骆驼生活环境中蝇种及分布,探讨不同蝇种作为骆驼斯氏副柔线虫病传播媒介的可能性。方法2007-2009年的7-9月对3个荒漠化草原地区骆驼生活环境中的蝇种进行调查。用网捕法收集,并利用传统的形态学分类方法对其进行种属区分。结果经鉴定,共发现蝇类9科17属25种,在内蒙古地区为新记录的有12种。其中从内蒙古巴彦淖尔地区采集2489只,优势蝇种为迷隰蝇,占该地区采集总蝇数的37.2%,其次为截脉角蝇,占23.0%。从阿拉善地区采集2260只,所占比例最大的是扁蝇科的蝇种,约为31.5%,粪蝇科的小纹鬃粪蝇占26.5%,其它蝇种所占比例均较小。从乌兰察布地区采集2343只,其中锯翅蝇科的蝇种所占比例最大,为43.4%,其次为海滨溜蝇和吸溜蝇,分别为10.6%和12.4%。结论基本掌握了内蒙古地区骆驼生活环境中的蝇种组成,为斯氏副柔线虫传播媒介的调查确定提供了重要的基础数据。