顺式氯氰菊酯对嗜人按蚊和斯氏按蚊幼虫蛋白含量、蛋白酶和羧酸酯酶活性的影响

目的 :探讨杀虫剂顺式氯氰菊酯 (奋斗呐 )灭蚊作用机理。方法 :分别用 0 .697nmol/ L、1.393nmol/ L奋斗呐处理嗜人按蚊和斯氏按蚊 3龄幼虫 ,待生长至 4龄 ,测定其蛋白质含量及蛋白酶和羧酸酯酶活力。结果 :与对照组相比 ,用药组幼虫蛋白质含量显著增加 ,蛋白酶与羧酸酯酶活力显著降低 ,具有非常显著性差异 ( P<0 .0 1)。结论 :本研究结果表明奋斗呐对蚊幼虫蛋白质含量及蛋白酶和羧酸酯酶活性均有显著的影响。

斯氏按蚊黑化包被约氏疟原虫卵囊时血淋巴蛋白的二维电泳分析

目的 以斯氏按蚊 约氏疟原虫为模型 ,用二维电泳技术分析比较约氏疟原虫感染后雌性斯氏按蚊吸饲硝喹蔗糖水和蔗糖水蚊血淋巴蛋白差异。方法 用挤压法分别收集吸硝喹糖水 3d、吸感染血和吸蔗糖水雌斯氏按蚊成蚊血淋巴 ,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度 ,继而对血淋巴进行双向电泳 ,凝胶考马斯亮蓝染色 ,ImageMasterVDS CL对二维电泳凝胶蛋白斑点扫描和用ImageMaster 2DElite软件进行蛋白质斑点自动分析。结果 用药组血淋巴蛋白浓度总是低于吸感染血组和吸糖水组 ,用药组蚊血淋巴蛋白点有 10 1个 ,对照组有 115个 ,有 5 1个蛋白点相同。 5 0个仅在用药组中检测到 ,64个仅在对照组中检测到 ;蛋白点的分子量和等电点主要位于 ( 4 0～ 60 )× 10 3 和碱性端。结论 二维电泳技术可直接反映蛋白质的差异 ,其蛋白浓度和白点的差异与硝喹诱导疟原虫卵囊黑化有关。

斯氏按蚊血淋巴游离氨基酸和蛋白的研究

用氨基酸自动分析仪测定斯氏按蚊血淋巴游离氨基酸的变化,用紫外吸收差法测定其蛋白浓度。感染约氏疟原虫蚊与正常蚊相比,吸血后第4d,6种氨基酸含量降低,5种氨基酸含量增加;吸血后第7d,4种氨基酸含量降低,7种氨基酸含量增加;吸血后第11d,9种氨基酸含量降低,4种氨基酸含量增加。感染蚊血淋巴蛋白浓度均高于同期正常蚊。

二维电泳-质谱分析斯氏按蚊中约氏疟原虫卵囊黑化相关的差异表达蛋白

目的 用 2 DE和PMF分离和鉴定约氏疟原虫卵囊黑化相关的斯氏按蚊中肠和血淋巴差异表达蛋白。方法 用固相pH梯度二维电泳分离中肠和血淋巴差异表达蛋白 ,考马斯亮蓝染色 ,ImageMasterVDS CL凝胶扫描和PDQuest2DElite软件分析 ,差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱 ,用PeptIdent软件查询SWISS PROT数据库。结果 获得了分辨率和重复性均较好的 2 DE考马斯亮蓝图谱 ,吸硝喹糖水组蚊血淋巴和中肠蛋白点分别有 10 1个和 10 4个 ,感染组分别有 115个和 162个 ,匹配点分别为 5 1个和 44个。斯氏按蚊血淋巴和中肠蛋白质组中蛋白点分别主要分布于酸性端和碱性端 ,血淋巴和中肠差异蛋白也分别主要分布于酸性端和碱性端。随机取2 5个差异蛋白点进行胶内原位酶解 肽质指纹图谱分析得到了 16个蛋白质肽质指纹图 ,查询数据库初步鉴定了 8个蛋白质 ,分别为与抗疟免疫、黑化、结构、糖代谢、细胞通讯等相关蛋白。结论 建立了一套重复性和分辨率较好的斯氏按蚊蛋白质分离和鉴定的二维凝胶电泳 肽质谱指纹分析法 ,约氏疟原虫卵囊黑化前后 ,斯氏按蚊血淋巴和中肠伴随大量差异表达蛋白 ,部分蛋白可能与黑化有关。

斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶基因克隆及其与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的克隆斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶基因,分析该分子与约氏疟原虫卵囊黑化关系。方法根据其它昆虫丝氨酸蛋白酶的保守氨基酸序列设计简并引物,以斯氏按蚊全蚊cDNA为模板,进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化,克隆入pUCm(T载体,测定插入片段序列,对序列进行BLAST检索和鉴定,根据序列设计相应基因的特异引物,然后分别从血淋巴细胞或中肠扩增目的基因,并进行不同食源条件下丝氨酸蛋白酶基因的半定量、原位核酸分子杂交定位与约氏疟原虫卵囊黑化关系的分析。结果获得了2种斯氏按蚊血细胞丝氨酸蛋白酶cDNA部分序列,即AsSP1(448bp)和AsSP2(472bp),分别与冈比亚按蚊SP2A和大劣按蚊SP2基因很相似,其编码的氨基酸序列均包含保守的丝氨酸蛋白酶催化功能域。在中肠和血淋巴内也获得相同的目的基因片段,半定量分析显示约氏疟原虫感染或诱导卵囊黑化呈现之前的表达明显增强,原位核酸分子杂交技术也进一步证实血细胞有AsSP1和AsSP2 mRNA表达。结论AsSP1和AsSP2很可能与疟原虫感染或约氏疟原虫卵囊黑化相关,推测可能是斯氏按蚊的前酚氧化酶的活化酶。

斯氏按蚊总RNA的提取与标本保存方法的研究

本研究利用Tripure试剂盒 ,成功地提取了斯氏按蚊总RNA ,并对不同方法保存的标本所提RNA的质量进行了比较 ,结果显示新鲜标本所提RNA质量最高 ,将标本在Tripure提取液中匀浆后置于 4℃保存的方法 ,较其它两种方法保存效果更好 ,此方法保存的标本 5天内进行RNA提取 ,能够保证质量。

抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的作用

目的观察抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的抑制作用。方法解剖实验室饲养斯氏按蚊雌蚊,取中肠(胃)制备中肠蛋白抗原并免疫BALB/c小鼠(8只,100μg/只),共免疫4次,每次间隔7～10d,末次免疫后10d,腋窝动脉取血,分离血清。用蛋白质印迹(Westernblotting)分析中肠蛋白的免疫活性抗原。用葡聚糖凝胶过滤法获得相对分子质量(Mr)为38000～50000的蛋白。用该中肠蛋白免疫小鼠(12只,100μg/只),共免疫4次,每次间隔7～10d。同时设PBS对照组。末次免疫后7d,ELISA检测小鼠血清中的抗体,抗体效价≥1:2560时,该免疫组小鼠和对照组小鼠经腹腔接种感染约氏疟原虫(约含2×107个感染疟原虫的红细胞),感染后3d取小鼠尾血镜检,雌配子体数>2/10个视野的小鼠作为供血鼠,斯氏按蚊成蚊吸血后9d解剖,计数中肠的卵囊数量。结果West-ernblotting显示斯氏按蚊中肠蛋白抗原的显色区带有8条,其中Mr38000～50000的区带显色较清晰;实验组和对照组中肠卵囊感染率分别为28.70%(62/216)和51.09%(47/92)(P<0.05),中肠卵囊指数分别为14.14(1541/109)和26.02(1223/47),两者差异有统计学意义(P<0.01)。结论斯氏按蚊Mr38000～50000中肠蛋白有免疫活性;针对该中肠蛋白的抗体对约氏疟原虫卵囊的发育有明显的抑制作用。

斯氏按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化的关系

[目的 ]探讨酚氧化酶 (phenoloxidase,PO)与疟原虫卵囊黑化的关系。 [方法 ]以斯氏按蚊 /约氏疟原虫为模型 ,对 4组斯氏按蚊 (不吸血组、吸正常血组、吸感染血组和硝喹组 )血淋巴进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)和凝胶图像分析 ,检测单酚氧化酶 (monophenoloxidase ,MPO)和二酚氧化酶 (diphenoloxidase,DPO)活性。 [结果 ]吸正常血组和不吸血组蚊血淋巴中MPO及o DPO活性无明显差异 ;与吸正常血组或不吸血组相比 ,感染组MPO及o DPO活性无明显变化 ,但用药组d1 0 则显著增加 ,d1 5 显著降低。 [结论 ]斯氏按蚊血淋巴中PO活性变化与约氏疟原虫卵囊黑化在时间上一致。

斯氏按蚊血细胞对约氏疟原虫卵囊黑化的影响

目的 探讨斯氏按蚊血细胞及血细胞PPO对疟原虫卵囊黑化的影响。方法 利用电镜观察蚊血细胞在卵囊黑化中的作用、RT -PCR检测蚊血细胞、蚊胃中PPOmRNA的表达、原位杂交检测血细胞中PPOmRNA的表达。结果 通过RT -PCR和原位杂交 ,发现斯氏按蚊PPOmRNA在血细胞中有表达 ,颗粒细胞可能是其主要的表达细胞 ;硝喹可使约氏疟原虫卵囊发生退行性变 ,卵囊黑化比率明显增加。结论 说明血细胞能够合成PPO ,进一步证实了蚊血细胞 ,特别是硝喹对卵囊的发育有抑制和阻断作用时 ,颗粒细胞在疟原虫卵囊黑化中起重要作用。

感染疟原虫斯氏按蚊血淋巴元素组成的分析

分别从初羽化及吸正常鼠血或感染约氏症原虫（Ｐｈｓｍｏｄｉｕｍｙｏｅｌｉｉｙｏｅｌｉｉ）鼠血后５、７、９ｄ的斯氏按蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）收集血淋巴，用ＩＣＡＰ－９０００型等离子原子发射光谱仪测定其常量元素和微量元素的含量，并对２０种元素含量变化作比较分析。初羽化蚊与吸血（正常鼠血和感染疟原虫的鼠血）后５ｄ的蚊相比，均有７种元素有非常显著的差异（Ｐ＜０．０１），１种元素有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。比较感染与未感染疟原虫的蚊血淋巴元素含量，显示吸血后５ｄ有１２种元素Ｐ＜０．０１．３种元素Ｐ＜０．０５；吸血后７ｄ，７种元素Ｐ＜０．０１，１种元素Ｐ＜０．０５；吸血后９ｄ，６种元素Ｐ＜０．０１，２种元素Ｐ＜０．０５。本研究结果表明，蚊虫血淋巴元素含量与其营养代谢及发育有密切关系。提示疟原虫的寄生可影响蚊媒血淋巴元素含量发生明显变化。

斯氏按蚊和中华按蚊中肠免疫活性抗原的研究

目的 鉴别斯氏按蚊和中华按蚊中肠具有阻断疟疾传播作用的免疫活性蛋白， 并对斯氏按蚊雌蚊中肠免疫活性蛋白在中肠的分布进行定位。方法 应用酶联免疫电转移印迹技术 （ Ｅ Ｉ Ｔ Ｂ） 分析斯氏按蚊雌、雄蚊和中华按蚊雌蚊中肠的免疫活性抗原； 用间接荧光抗体技术 （ Ｉ Ｆ Ａ） 对斯氏按蚊雌蚊中肠免疫活性抗原进行定位。结果 斯氏按蚊雌、雄蚊蚊中肠抗原及中华按蚊雌蚊中肠抗原与斯氏按蚊雌蚊中肠抗血清作用， 分别显示９ 、９ 和６ 条蛋白带； 斯氏按蚊雌蚊中肠壁外侧出现较强的亮绿色荧光， 肠壁细胞核仅出现样弱的亮绿色荧光。结论 上述三种抗原间既有相同的免疫活性蛋白带， 也有各自特异的蛋白带， ７９ 、７６ 、６０ 、４６ｋ Ｄａ 的蛋白带为斯氏按蚊雌蚊中肠特异性免疫活性蛋白带； 斯氏按蚊雌蚊中肠免疫活性蛋白主要分布在中肠肠壁外侧， 仅有少量分布在肠壁细胞核。

约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶的变化

目的 比较分析约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶 (prophenoloxidase ,PPO)的分布及其变化 ,探讨中肠PPO与按蚊抗疟原虫感染免疫防御反应的关系。方法 解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后 3、5、7、11和 15d斯氏按蚊与大劣按蚊的中肠。利用烟草天蛾PPO抗体分别进行免疫组化染色和免疫印迹分析。结果 斯氏按蚊与大劣按蚊在未感染约氏疟原虫前的中肠循环管道内均已存在PPO ,而感染后循环管道内的PPO扩散到中肠组织间隙并聚集成片状、块状或条索状 ,大劣按蚊中肠PPO的聚集程度大于斯氏按蚊 ;在感染前和感染后不同时期免疫印迹均可检测到斯氏按蚊与大劣按蚊中肠PPO蛋白带 ,分子量约为 67× 10 3,感染后的PPO蛋白带型比感染前明显增强 ,而且大劣按蚊中肠PPO蛋白带型比斯氏按蚊尤为明显。结论 约氏疟原虫感染前按蚊中肠循环管道内存在的PPO可能是经与血淋巴相通的循环管道扩散而来 ,感染后导致的中肠内PPO不同分布及其变化可能与疟原虫感染按蚊密切相关 。

斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶差异表达与疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的 探讨斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶与疟原虫卵囊黑化的相互关系。方法 斯氏按蚊分吸糖水组、吸正常小白鼠血组、吸约氏疟原虫感染血组和吸硝喹糖水组 ,挤压法收集雌斯氏按蚊血淋巴 ,解剖后取吸硝喹糖水蚊第 1、2和 3天斯氏按蚊中肠 ,超声提取中肠蛋白 ,Bradford法检测血淋巴总蛋白浓度 ,继而对血淋巴和中肠蛋白进行SDS -PAGE ,Western印迹电转移后检测前酚氧化酶。结果 四组血淋巴前酚氧化酶和用药后中肠前酚氧化酶均呈现一条阳性蛋白带 ,分子量分别均约 6 6kDa,与吸糖水组比较 ,吸正常小白鼠血组血淋巴前酚氧化酶表达增强 ,而感染后血淋巴前酚氧化酶表显著增强。硝喹诱导黑化后血淋巴前酚氧化酶表达水平呈逐日下调趋势 ,而硝喹诱导黑化过程中中肠前酚氧化酶量逐渐增加。结论 斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶参与疟原虫卵囊黑化反应。

斯氏按蚊的有丝分裂染色体核型、G带的初步研究

采用加热干燥涂片法对斯氏按蚊的有丝分裂染色体核型、G带进行了研究.结果表明:斯氏按蚊染色体数目为2n =6 ,属XY型,全部为中着丝粒染色体;Y染色体存在中着丝粒和端着丝粒染色体两种形态:在G带中,两对常染色体在着丝粒附近颜色较深,性染色体X、Y的一条臂全部深染,另一臂分别呈现4条和3条带;雄蚊共有2 1条带.研究中还观察到了染色体多态现象.

斯氏按蚊配子体激活因子活性变化与产卵的关系

目的探讨斯氏按蚊唾液腺中疟原虫配子体激活因子的变化趋势与蚊卵发育及产出的关系。方法应用体外雄配子体出丝观察方法检测雌性斯氏按蚊唾液腺抽提物及卵巢匀浆上清中配子体激活因子对伯氏疟原虫雄配子体出丝诱导活性的动态变化;分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Bradford蛋白分析法检测两器官蛋白成分或含量的变化。结果吸血后按蚊唾液腺抽提物的出丝诱导活性显著下降,未产卵组和产卵组按蚊的活性分别于吸血后第8日和第4日恢复到吸血前水平;卵巢匀浆上清的诱导活性亦在吸血后下降,吸血后第2日显著升高,未产卵组保持该活性水平至吸血后第8日,产卵组诱导活性于吸血后第4日(产卵翌日)回落。两组按蚊唾液腺蛋白组成未见明显区别;吸血后第2日,卵巢的蛋白含量达到峰值,未产卵组按蚊卵巢蛋白含量维持在高水平直至吸血后第6日,而产卵组按蚊卵巢蛋白含量在吸血后第4日则恢复到吸血前的水平。结论按蚊唾液腺中配子体激活因子的消长与雌蚊体内蚊卵的发育、成熟及产出之间存在某种内在的生理联系。

斯氏按蚊血淋巴蛋白浓度的检测及其意义

目的 了解斯氏按蚊成蚊在不同食源条件下血淋巴蛋白浓度的变化。 方法 挤压法分别收集 4组 (吸蔗糖水组、吸正常血组、吸感染血组和吸硝喹组 )斯氏按蚊成蚊血淋巴 ,采用Bradford法测定血淋巴蛋白浓度 ,并进行Ex cel自动分析。 结果 吸血感染约氏疟原虫 8d后 ,吸感染血组血淋巴蛋白浓度高于吸蔗糖水组和吸正常血组 ,平均分别为 4.43 6、3 .0 80和 3 .0 92 μg/μl ,通常硝喹组浓度 ( 2 .2 64 μg/μl)低于吸感染血组。 结论 吸硝喹组蚊体内血淋巴蛋白浓度下降 ,提示蚊血淋巴蛋白可能参与疟原虫卵囊的黑化包裹反应。

约氏疟原虫感染斯氏按蚊后血淋巴PPO的酶解激活

目的 了解约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊是否发生黑化相关性酶级联反应。方法 挤压法收集雌斯氏按蚊成蚊血淋巴 ,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度 ,然后对血淋巴进行一维和二维SDS PAGE ,继而利用Western印迹分析比较PPO蛋白点的差异。结果 约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊之前的血淋巴蛋白二维凝胶电泳后的Western印迹的PVDF膜上出现 2个分子量均约为 64× 10 3、等电点分别约为 7 4和 7 6的两个PPO蛋白点 ,感染后发现 8个蛋白点 ,3 6×10 3分子量处 3个 ,等电点分别约为 7 2、7 4和 8 0 ;3 0× 10 3分子量处 5个 ,等电点分别约为 7 0、7 2、7 5、7 6和 7 8。结论 约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊之前的血淋巴PPO以异二聚体形式结构性表达于血淋巴内 ,感染后PPO发生免疫激活反应和酶学分解过程 ,提示PPO参与疟原虫卵囊黑化包被反应。

斯氏按蚊血淋巴在约氏疟原虫卵囊黑化时差异表达蛋白的SDS-PAGE分析

目的 初步了解约氏疟原虫感染后的雌斯氏按蚊成蚊吸饲硝喹蔗糖水和蔗糖水后不同时间的血淋巴蛋白差异表达。方法 挤压法分别收集两组雌斯氏按蚊成蚊 1～ 5d的血淋巴 ,经SDS PAGE ,考马斯亮蓝和银染显色 ,Bio Rad10 0 0凝胶图像分析系统进行扫描和差异蛋白条带的自动化分析。结果 用药第 2天少数蚊卵囊开始部分黑化 ,第 5～9天黑化蚊及其黑化卵囊逐渐增多。用药后第 3天处理组蚊血淋巴蛋白条带数明显多于对照组 ,两组间存在较多差异蛋白带 ,主要集中在 ( 2 0～ 40 )× 10 3、( 60～ 80 )× 10 3和 13 0× 10 3处。银染比考马斯亮蓝染色出现的蛋白条带数多。结论 约氏疟原虫感染的雌斯氏按蚊成蚊吸饲硝喹糖水后其血淋巴蛋白表达有差异 。

蒿甲醚对约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育影响

目的研究蒿甲醚对约氏疟原虫在大劣按蚊体内发育的影响及其机制。方法本课题利用已经建立的斯氏按蚊-约氏疟原虫模型,通过吸饲蒿甲醚糖水的方法,观察蒿甲醚是否影响约氏疟原虫在斯氏按蚊体内的发育。通过RT-PCR方法,分析NOS、TEP1和PPO三个斯氏按蚊重要的免疫反应相关基因的表达变化,以了解青蒿素类药物蒿甲醚影响疟原虫在按蚊体内的发育机制。结果蒿甲醚可以促进疟原虫在按蚊体内的发育,使卵囊数量增长3-5倍。对其机制的研究中发现,斯氏按蚊吸饲蒿甲醚后,使NOS、TEP1和PPO三个免疫相关基因在转录水平下调,提示蒿甲醚可能通过抑制NO产生,丝氨酸级联反应及溶解反应,降低按蚊免疫反应,促进疟原虫在按蚊体内发育。结论蒿甲醚可能通过抑制斯氏按蚊免疫相关基因的表达,促进约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育。

斯氏按蚊产卵前后不同器官对伯氏疟原虫出丝诱导活性的影响

为分析斯氏按蚊产卵与头、唾液腺和卵巢组织中出丝诱导活性动态的相互关系,应用雄配子体体外出丝检测雌性斯氏按蚊产卵前后头、唾液腺及卵巢抽提物对伯氏疟原虫雄配子体出丝诱导活性的动态变化。结果表明:产卵前后各时相点之间-头部抽提物的出丝诱导活性未发生有意义的变化。吸血后1h内按蚊唾液腺抽提物的出丝诱导活性显著下降,产卵翌日恢复到吸血前水平;卵巢匀浆上清的诱导活性亦在吸血后下降,吸血后第2日显著升高,产卵翌日回落。斯氏按蚊唾液腺和卵巢的出丝诱导活性在产卵后相互消长,这些变化可能与蚊卵的发育、成熟及产出相关。