兔斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫PCR检测靶标的筛选与单一、多重直接PCR检测方法的建立

旨在建立快速、简便的兔斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫直接PCR检测方法。首先克隆斯氏艾美耳球虫线粒体基因组mtDNA和3种兔球虫顶质体基因rpoB,结合GenBank中收录的其它兔球虫的相关序列进行比对分析,然后以种间差异明显的序列为靶基因在其超变区设计多对特异性引物,同时对引物浓度等条件进行优化,并评价PCR方法的敏感性和特异性。本研究首次测定了斯氏艾美耳球虫线粒体基因组全序列和3种兔球虫顶质体基因rpoB的序列,斯氏艾美耳球虫mtDNA全长6277 bp,包括3个蛋白质基因,与其它6种兔球虫mtDNA序列相似率为93.90%~97.45%;斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫顶质体基因rpoB大小在500 bp左右,三者相似性达93.93%~95.30%。靶基因筛选结果表明3种兔球虫ITS与其它基因(rpoB和mtDNA)相比较具有种内保守和种间差异大的特点,更适合用于分子诊断;基于3种兔球虫ITS序列的引物中,Ps1、Pi2、Pm2在单一或多重检测时均具有良好的特异性和敏感性。本试验通过对艾美耳球虫PCR检测候选基因靶标(ITS、mtDNA和rpoB)进行序列分析,筛选ITS为兔球虫种间差异明显的检测靶标基因,在此基础上建立的单一直接PCR方法和多重直接PCR方法具有特异、敏感、操作简便的优点,可用于3种兔球虫的流行病学调查或兔球虫病临床诊断。

斯氏艾美耳球虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白对兔的免疫保护效果评价

旨在评价斯氏艾美耳球虫重组蛋白Es-GAPDH对兔的免疫保护效果,为兔斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。利用相对荧光定量PCR分析Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫不同发育时期的转录水平,并对Es-GAPDH进行原核表达与蛋白纯化;然后将42只45日龄无球虫幼兔随机分为5组(空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEs-GAPDH免疫组),分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白含1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1 mL 100μg rEs-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫。二免14 d后除空白对照组外,其余各组实验兔经口感染1×10^(4)个斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,攻虫后观察各组临床表现,每周定时采血、称重,感染21 d后剖检观察肝组织病理变化,并测定和统计每组的相对增重、料肉比、肝指数、卵囊排出量、生化指标、特异性IgG抗体以及细胞因子等。结果发现,Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫各个发育阶段均有转录,且转录水平存在差异,在孢子化卵囊阶段转录水平最高。免疫保护试验表明:感染后不免疫攻虫组出现兔肝球虫病典型症状,而rEs-GAPDH免疫组症状不明显。rEs-GAPDH免疫组的卵囊减少率达87.09%,相对增重率显著大于三个攻虫对照组(P<0.05),特异性IgG抗体水平、细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β)水平均与不免疫攻虫组存在显著差异(P<0.05),组织病理切片也显示,免疫组相较不免疫攻虫组肝组织被破坏程度低,虫体数量较少。综上,斯氏艾美耳球虫重组蛋白rEs-GAPDH可减少增重损失和卵囊排出,能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答,具有一定免疫保护作用,可作为斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。

斯氏艾美耳球虫子孢子的移行途径

关于斯氏艾美耳球虫Ｅｉｌｎｅｒｉａｓｔｉｅｄａｉ（Ｓｐｏｒｏｚｏａ：Ｅｉｍｅｒｉｉｄａｅ）子孢子的移行途径争议尚大。作者借光镜和电镜互补的手段研究了子孢子从肠腔到肝内胆管上皮细胞的移行。所取材料为人工感染５～５０万卵囊的１月龄幼兔的血液、肠道、淋巴结、脾和肝，取材料时间为感染后２～７２ｈ（２ｈ的间隔）至４～６６（１６的间隔）。依据子孢子大量出现于肠系膜淋巴结和小量出现于脾脏而未见于其它部位淋巴结，以及肝内胆管周围营养血管（胆管周毛细血管丛）中有大量子孢子出现等观察结果，提出了子孢子移行途径的新假说，即子孢子进入肠固有层淋巴管、肠系膜淋巴结、经乳糜池转入血循环、由肝动脉至汇管区胆管周毛细血管丛并由此处侵入胆管上皮细胞。

斯氏艾美耳球虫的致病性及病理学研究

用纯种斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊人工感染25只断奶幼兔,进行致病性和病理学研究。试验兔分为1个不感染对照组和4个感染组,各感染组每只幼兔分别口服感染2.0×103、1.0×104、5.0×104、2.5×105个孢子化卵囊。与对照组相比,接种2.0×103个和1.0×104个孢子化卵囊的两个感染组的平均病变记分、肝重指数、血清转氨酶活性有显著差异(P<0.05);接种5.0×104个和2.5×105个孢子化卵囊的两个感染组上述指标有极显著差异(P<0.01)。表明斯氏艾美耳球虫对幼兔具有很强的致病性,能导致严重的肝球虫病。

NOS底物、抑制剂及NO供体在兔斯氏艾美耳球虫感染时作用的研究

为了探讨兔斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)感染时试验家兔肝的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性和血清中NO浓度变化以及NO对兔球虫的抑制或杀伤作用,通过腹腔注射的途径给予感染E.stiedai的家兔不同浓度的NOS底物L-精氨酸(L-Arg)、NO供体硝酸甘油(GTN)和iNOS抑制剂L-氨基胍(L-AG),利用NOS活性测试盒测定肝的iNOS活性,用硝酸还原酶法测定血清中NO的浓度,采用麦克马斯特氏法计数每克粪便的球虫卵囊数(OPG),根据试验兔肝的剖检和镜下病变来进行病变计分。结果表明:感染E.stiedai后,家兔肝匀浆的iN-OS活性和血清中NO浓度逐渐升高,感染对照组、添加L-Arg组、GTN组、L-AG组4组均在感染后第12 d达到最高值,而后逐渐下降,于23 d左右下降到感染前的水平;L-Arg可增强肝的iNOS活性,使其释放大量NO,产生对球虫的抑制或杀伤作用,减轻球虫感染引起的病变;硝酸甘油可在兔体内释放NO,对球虫产生一定的抑制作用,稍减轻球虫感染引起的病变;相反,L-AG则抑制肝的iNOS活性,使生成的NO减少,对球虫的抑制作用减弱甚至消失,从而加重球虫感染引起的病变。结果提示:NO及iNOS确实参与了家兔E.stiedai的感染过程,并且NO在球虫感染过程中起到了抑制或杀伤球虫的作用。

斯氏艾美耳球虫MIC-5与兔IL-15基因在真核细胞中的共表达

【目的】构建能在真核细胞中共表达斯氏艾美耳球虫微线蛋白5(MIC-5)和兔IL-15重组载体,为进一步研究抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗奠定基础。【方法】将斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因,克隆到真核双表达载体pBudce4.1中,应用脂质体介导法将构建的重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞。在转染后,用RT-PCR法和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测MIC-5和IL-15基因在BHK-21细胞中的转录和表达情况。【结果】在重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞24 h后即可检测到MIC-5、IL-15基因进行了转录;在转染36、48、72h后,MIC-5和IL-15基因可同时在BHK-21细胞中表达。【结论】成功构建了含有斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因的重组载体,实现了两种基因在真核细胞中的共表达,为抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗研制奠定了基础。

斯氏艾美耳球虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列的克隆及PCR检测方法的建立

通过对多种鸡球虫和松鼠球虫18SrRNA和28SrRNA进行序列比对分析,在18SrRNA 3′端和28SrRNA 5′端保守区设计艾美耳属通用引物,以斯氏艾美耳球虫洛阳分离株LY卵囊基因组DNA为模板首次成功克隆到斯氏艾美耳球虫完整的ITS1-5.8SrRNA-ITS2序列,其大小为1 178bp,其中ITS1序列长度为423bp,5.8SrRNA为155bp,ITS2为600bp,斯氏艾美耳球虫LY株ITS1/2序列高度变异,与鸡球虫、啮齿动物球虫的序列相似性低于60%。然后在斯氏艾美耳球虫ITS1/2序列超变区设计种特异引物,建立了灵敏、特异的PCR检测方法。本研究结果将为兔球虫强致病种的临床诊断和揭示兔球虫种群遗传特征提供有效的分子工具。

广东省肉鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)抗药性调查

从广东省的中山、东莞、顺德、花都、广州江村镇、梅州、新兴县。新会和四川省泸县分离到９个柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella)虫株，用接种雏鸡的方法测定了它们对常山酮、氯嗪苯乙氰、球痢灵、尼卡巴嗪、氯羟毗啶、马度拉霉素、拉沙洛菌素、盐霉素、莫能霉素等９种药物的抗药性，结果表明：中山虫株对常山酮和尼卡巴嗪敏感，对克球粉轻度抗药，而对其余６种抗球虫药物则严重抗药；东莞虫株对尼卡巴嗪敏感，对常山酮、氯嗪苯乙氰、克球粉、马杜拉霉素轻度抗药，对拉沙洛菌素中度抗药，对盐霉素严重抗药；顺德虫株和江村虫株除对尼卡巴嗪轻度抗药外，对其余８种抗球虫药物均严重抗药；梅州虫株对尼卡巴嗪敏感，对常山酮和马杜拉霉素轻度抗药，对其余５种药物严重抗药；新会虫株对尼卡巴嗪敏感，对克球粉和拉沙洛菌素中度抗药。对其余５种药物均严重抗药；新兴虫株对尼卡巴嗪敏感，对常山酮、马杜拉霉素和球痢灵中度抗药，对其余４种药物严重抗药；花都虫株对尼卡巴嗪轻度抗药，对常山酮、氯嗪苯乙氰和克球粉中度抗药，对其余４种药物严重抗药．四川虫株对尼卡巴嗪、氯嗪苯乙氰敏感，对马杜拉霉素轻度抗药，对球痢灵、克球粉、盐霉素和拉沙洛菌素中度抗药，对莫能霉素和常山酮则严重抗药，由此可以看出?

斯氏艾美耳球虫子孢子的超微结构

斯氏艾美耳球虫子孢子呈香蕉形，外被三层膜组成的表膜，有前后极环；顶复合器具典型结构，棒状体为８根；核一个，位于虫体前半部，含一个偏心核仁；相当于核中部水平位置的表膜上，见有一微孔；折光体在核后，呈球形，约占子孢子纵长的２／５；尾部常见一兔尾巴式的结构，构成方式类似阿米巴的伪足，是由被表膜的胞质向外突出形成的；胞质中见有许多管泡状线粒体和一些电子致密体。

斯氏艾美耳球虫小配子的发育及其超微结构

结合光镜和电镜、切片和涂片技术 ,对斯氏艾美耳球虫 (Eimeriastiedai)小配子发育期的超微结构进行了研究。小配子发育分 2个阶段———生长与核分裂阶段及小配子的形成与分化阶段。早期小配子体单核 ,核仁小 ;随着核的分裂变为双核、四核和多核小配子体 ,后者因核极多 ,浅层分叶形成小配子体胚以利于核周边排列。各小配子体胚周边的核与嵌于核前方的线粒体向前突出并生长 ,最后分化形成小配子落入带虫空泡。成熟的小配子有 2根鞭毛、1个大线粒体和 1个强嗜锇性核、被单层膜。

斯氏艾美耳球虫孢子生殖及其致病性研究

目的采用单卵囊分离技术分离斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai),观察其卵囊在孢子化过程中的发育形态变化。方法通过人工感染断奶幼兔,以潜伏期、死亡率、肝指数、血清中转氨酶数值、肝脏病变记分等指标研究其致病性。结果采用单卵囊感染技术成功分离了E.stiedai单卵囊,卵囊在29℃条件下最早孢子化形成时间为39 h,潜在期为13～15 d,感染率为20%。结论用继代增殖的纯株E.stiedai人工接种试验兔,在一定范围内其致病性随感染剂量的增加而增强。

L-精氨酸和L-氨基胍在兔斯氏艾美耳球虫感染中作用的研究

为了探讨兔斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)感染兔肝脏诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性和血清NO浓度变化以及NO对兔球虫的抑制或杀伤作用,以腹腔注射途径给予球虫感染家兔一氧化氮合酶(NOS)底物L-精氨酸(L-Arg)和iNOS抑制剂L-氨基胍(L-AG),对家兔球虫感染时肝脏iNOS活性、血清NO浓度、每克粪便的球虫卵囊数(OPG)、肝的剖检和镜下病变及其病变计分进行了研究。试验结果表明:①家兔感染E.stiedai后,肝匀浆的iNOS活性和血清中NO浓度逐渐升高,感染对照组、添加L-Arg组和添加L-AG组3组均在感染后第12天达到最高值,而后逐渐下降,于23 d左右下降到感染前的水平;②L-Arg可增强iNOS的活性,促进体内大量生成NO,进而提高家兔对球虫的抑制作用,减轻球虫感染引起的病变;L-AG则降低iNOS的活性,使体内生成的NO减少,从而加重球虫感染引起的病变。结果提示:NO及iNOS确实参与了家兔E.stiedai的感染过程,并且NO在球虫感染过程中起到了抑制或杀伤兔球虫的作用。

斯氏艾美耳球虫裂殖生殖的多态现象

迄今描述的艾美耳科和住肉孢子虫科球虫的裂殖生殖多为单态，作者发现斯氏艾美耳球虫的裂殖生殖具多态性，其方式有：子孢子型裂殖体以内单多生殖方式产生下代裂殖子；双或多核的裂殖子型裂殖体或以内二多生殖方式或以外单多生殖方式产生下代裂殖子；单核裂殖子型裂殖体以外多多生殖方式产生下代裂殖子；经典型裂殖体以内单多和外单多混生方式产生下代裂殖子。这种裂殖体以多态的方式产生下代裂殖子的现象称为裂殖生殖的多态现象。依据前人以及作者的观察，作者提出两项建议：（１）将艾美耳科和住肉孢子虫科球虫的不同形态的裂殖体归为三型，即子孢子型、裂殖子型和经典型；（２）将此两科球虫的内生方式归为四型，即内单多生殖、内二双生殖、内二多生殖和内多多生殖；将外生方式归为三型，即外单多生殖、外二多生殖和外多多生殖；将斯氏艾美耳球虫的一种特殊生殖方式归为内单多和外单多混生殖。球虫裂殖生殖的多态性反映球虫遗传物质的多型性。

斯氏艾美耳球虫感染对兔肝脏和血清抗氧化功能的影响

为研究斯氏艾美耳球虫对兔肝脏及血清抗氧化功能的影响,本实验以30日龄～45日龄兔为研究对象,测定兔接种斯氏艾美耳球虫后,血清和肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性及丙二醛(MDA)含量。结果表明:感染斯氏艾美耳球虫后,SOD、CAT和GSH-Px的活性均有不同程度的下降,MDA含量高于对照组水平,各指标在感染急性期后逐步回升至对照组水平。表明病理氧化应激参与了球虫感染过程,损伤了机体的抗氧化平衡,同时其变化规律也符合球虫自限性感染的特点。

斯氏艾美耳球虫大配子发育及其超微结构

凭借光镜和电镜、切片和涂片技术相结合之手段 ,作者对斯氏艾美耳球虫 (Eimeriastiedai)大配子发育及其超微结构进行了研究。大配子发育历经早、中、晚 (成熟 ) 3期。早期虫体以大核、大核仁和数个早期形态的成囊颗粒Ⅰ (WFⅠ )的出现为特征 ;中期虫体以成囊颗粒Ⅱ (WFⅡ )之出现为特征 ,含大量脂肪体和支链淀粉颗粒并出现小管构造 ;成熟期大配子体即大配子 ,被单层膜 ,WFⅠ和WFⅡ周边排列 ,含极多的脂肪体和支链淀粉颗粒 ,有一明显核仁的大核 ,小管构造增多。

斯氏艾美耳球虫感染兔血常规及肝脏功能分析

为了对斯氏艾美耳球虫感染兔的血常规、肝功能和凝血4项进行检测分析。通过孢子化的斯氏艾美耳球虫卵囊口服接种的途径感染8只2月龄的无球虫新西兰兔,8只不感染的设为阴性对照组。感染30 d后,心脏采血采集血液样本,测量血常规、肝功能和凝血4项等血液指标。血液检测结果显示,与肝功能相关的8项指标中,仅有谷氨酰肽转移酶、血清胆碱酯酶差异显著,其余均差异极显著,血常规和凝血4项亦差异极显著。表明兔感染斯氏艾美耳球虫1个月后肝功能严重受损。

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因表达产物的初步免疫效果研究

用柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)子孢子表面抗原基因原核细胞表达产物免疫雏鸡,观察其对球虫攻击的免疫保护作用。将可溶性重组蛋白和包涵体重组蛋白经肌肉注射分别于7日龄、14日龄两次免疫罗曼小公雏,同时设攻虫对照组和空白对照组,于第2次免疫后1周(28日龄)用1×104个E.tenella卵囊进行攻毒,观察其诱导产生的保护力。结果表明,3-1E可溶性蛋白组免疫无论从卵囊计数、盲肠病变计分和相对增重均优于包涵体免疫组。说明3-1E基因在大肠杆菌中的表达产物对鸡柔嫩艾美耳球虫的攻击有一定的免疫保护作用。

鸡艾美耳球虫3-1E基因的克隆与表达

应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)技术 ,分别从柔嫩艾美耳球虫甘肃株 (E.tenella GS,Et GS)和堆型艾美耳球虫青海株 (E.acervulina QH,Ea QH)孢子化卵囊子孢子中提取的总 RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原 3- 1E基因 (Et GS3-1E和 Ea QH 3- 1E)。将 Et GS3- 1E与原核表达载体 p GEX- 6 P1连接 ,构建了的 p GEX- 3- 1E原核表达质粒 ,并获得融合蛋白的高效表达和纯化。序列分析表明 :Et GS3- 1E和 Ea QH 3- 1E的 ORF均为 5 13个碱基 ,共编码 171个氨基酸。Et GS3- 1E的蛋白分子量为 18.5 k D,Ea QH 3- 1E的蛋白分子量为 18.6 k D。ORF比较 ,Et GS3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 2个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.8%,有 1个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 99.4 %;Ea QH 3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 4个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 97.7%,有 3个氨基酸变异 ,氨基酸同源性为 98.3%;Et GS 3- 1E与 Ea QH 3- 1E比较 ,有 3个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.2 %,有 2个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 98.8%。获得了 Et GS 3- 1E融合蛋白的高效表达和纯化 ,表达率达 4 3.2 %。

斯氏艾美耳球虫热休克蛋白70基因的克隆及表达分析

为了获得斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)的热休克蛋白70(HSP70)的全基因序列,并诱导表达重组HSP70蛋白,试验根据免疫蛋白组学研究的质谱结果获得的部分氨基酸序列和已发布近源物种HSP70蛋白序列设计引物,通过c DNA末端快速扩增法(RACE)获得E.stiedai HSP70的全基因序列,将其连入原核表达载体p ET-28a(+),转化Competent Rosetta2(DE3)p Lys S,通过IPTG诱导表达重组HSP70蛋白,并进行Western-blot分析。结果表明:HSP70序列全长为2 727 bp,最大ORF为2 010 bp。HSP70在诱导后37℃培养4 h条件下有表达,但全部为不溶性表达;在诱导后20℃过夜培养条件下无表达。说明试验成功获得E.stiedai HSP70的全基因序列以及重组HSP70蛋白。

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因的克隆、表达与蛋白结构预测

应用PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊子孢子cDNA表达文库中扩增得到鸡E.tenella杨凌株(YL)子孢子表面抗原3-1E基因。序列分析表明,E.tenella YL 3-1E基因的开放阅读框(ORF)为513个碱基,编码170个氨基酸,与报道的E.tenella甘肃株(GS)3-1E基因相似性为99.8%,两者推导的氨基酸序列相似性为99.4%;而与文献报道的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)美国株(US)3-1E基因序列的相似性为98.8%,推导的氨基酸序列相似性为98.8%。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功地表达出了分子量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础。