实时荧光定量PCR检测猴痘病毒的方法研究

目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立猴痘病毒RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测;对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核酸进行检测,对RT-PCR方法检测临床样本能力进行评价。结果本研究建立的RT-PCR检测方法可实现猴痘病毒的特异性检测,与天花、痘苗、牛痘等其他正痘病毒无交叉反应,检测重复性好,最低检测限为103copies/μL。可以对人皮肤拭子样本中的猴痘病毒进行准确检测。结论本研究建立了猴痘病毒的RT-PCR检测方法,可在临床样本中快速、特异、灵敏的检测猴痘病毒。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

实时荧光定量PCR检查在献血者乙型肝炎病毒核酸检测中的应用

目的探究献血者乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测中,实时荧光定量PCR检查的应用价值。方法选取2022年10月至2023年9月宁德市中心血站10403份献血者标本,对其进行乙型肝炎病毒检测。ELISA检测用A、B两种不同试剂进行初检、复检,对检测阴性的血液标本进一步行核酸检测。结果经ELISA检测,A试剂初检乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性率为0.57%(59/10403);B试剂复检HBsAg阳性率为0.65%(68/10403)。对阴性血液标本进一步核酸检测,A试剂初检HBsAg阴性标本的阳性率为0.261%(27/10344);B试剂复检HBsAg阴性标本的阳性率为0.174%(18/10335)。结论献血者HBV检测使用核酸检测有助于提高血液筛查的准确性,保障用血安全。

猪圆环病毒3型TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为建立猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)快速、灵敏且特异的检测方法,针对PCV3全基因组的保守区域设计特异性引物,构建标准质粒,通过优化反应体系和反应程序,建立基于TB GreenⅡ的实时荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、重复性和可行性进行验证。结果显示,建立的TB GreenⅡqPCR检测方法特异性良好,在4.74×10^(2)~4.74×10^(7)拷贝/μL的标准质粒间具有良好的线性关系(R^(2)=0.999)。建立检测方法的最低检出限为10拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)无交叉反应,组内变异系数为0.33%~0.62%,组间变异系数为0.40%~0.73%。对收集的132份临床样品进行检测,PCV3 TB GreenⅡqPCR方法检出率为9.10%(12/132),高于PCV3常规PCR方法的检出率(4.55%,6/132)。综上,建立的PCV3 TB GreenⅡqPCR检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样品中PCV3感染的诊断、流行病学监测和实验室研究等。

高危型HPV感染临床检验中实时荧光定量PCR检测法的作用

目的分析高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染临床检验中实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测法的作用。方法选取80例疑似高危型HPV感染患者,均接受第二代杂交式捕获法(HCⅡ)、实时荧光定量PCR检测,以病理检查结果为金标准,分析实时荧光定量PCR检测价值。结果实时荧光定量PCR检验准确率97.50%、敏感度98.51%、特异度92.31%,均显著高于HCⅡ的78.75%、88.06%、38.46%(P<0.05);实时荧光定量PCR诊断检出率CINⅠ100%、慢性宫颈炎92.31%,均显著高于HCⅡ的88.10%、46.15%(P<0.05)。结论应用实时荧光定量PCR检测法可明显提高高危型HPV感染患者的临床检验准确性,提高治疗方法的针对性。

猪源盖塔病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪盖塔病毒感染是由盖塔病毒(GETV)引起母猪妊娠初期胎儿死亡、初生仔猪发病的一种繁殖障碍性疾病。猪是自然界中GETV的主要扩增宿主,可以产生足够高的病毒血症滴度来感染叮咬的蚊子并维持GETV的传播周期,所以定期对猪群进行GETV监测对于预防潜在的GETV暴发具有重要意义。本研究通过分析GETV E2蛋白基因特征,设计特异性引物和探针,条件优化后建立检测GETV感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:以阳性质粒为标准品建立的标准曲线在1×10^(2)~1×10^(7)copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为1.61;该检测方法的最低检出限低至3.16 TCID50/mL,远远低于普通PCR的检测限3.16×10^(3)TCID50/mL;组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。本研究建立的方法能够快速有效的检测和定量GETV,为猪群中GETV监测提供可靠的检测方法。

蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的实时荧光定量PCR检测

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,简称ORSV)是蝴蝶兰生产中的主要病毒病害,建立稳定、灵敏的检测体系是进行病毒早期检测和脱毒技术研究的前提。本研究首先对CymMV和ORSV的外壳蛋白(coat protein,简称CP)基因片段进行克隆和序列比对,随后设计特异性引物,分别构建2种病毒的RT-qPCR(real time quantitative PCR,简称RT-qPC)检测体系,并对云南地区20份样品进行检测。研究结果显示,CymMV和ORSV CP基因序列与其他地区分离物中这2种病毒的核苷酸序列相似性分别为97.92%~98.66%和99.12%~99.56%,其CP基因序列具有保守性。CymMV和ORSV在RT-qPCR体系中最低检出浓度分别为30.9、35.0 copies/μL,灵敏度较RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,简称RT-PCR)提高10倍。利用RT-qPCR体系对20份温室样品进行检测,CymMV阳性率为100%,ORSV阳性率为90%,阳性率均高于RT-PCR检测结果。本研究构建的CymMV和ORSV RT-qPCR检测体系将为蝴蝶兰病毒病早期监测和脱毒种苗的培育奠定基础。

塞内卡病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为加强塞内卡病毒(SVA)在不同宿主的诊断及流行病学监测与防控,根据GenBank中发表的SVA VP1基因区域设计一对特异性引物和带有TaqMan发光基团标记的探针,构建重组阳性质粒并用作建立实时荧光定量RT-PCR方法的模板,对反应体系和条件进行优化,构建标准曲线并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法的最适退火温度为55℃,最佳引物和探针浓度分别为0.2μmol/L和0.4μmol/L,最佳反应循环数为45,Ct值与标准品浓度的对数线性关系好。对猪源、鼠源及牛源SVA和其他动物病毒(O型口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、边界病毒、猪库布病毒、牛库布病毒、山羊鼻内肿瘤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛冠状病毒、D型流感病毒、蓝舌病毒)的核酸检测结果显示,除猪源、鼠源及牛源SVA为阳性外,其他病毒核酸为阴性。该方法最低检测限为2.66×10~1拷贝/μL,重复试验中组内和组间变异系数均小于0.1%。建立的检测多宿主SVA TaqMan RT-qPCR方法具有良好的特异性和稳定性,为SVA在不同宿主间的疾病诊断与流行病学调查或监控提供了快捷的方法。

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的快速定量检测方法,本研究针对IBRV基因组gD序列保守区域设计特异性扩增引物,扩增的目的片段大小为105 bp,将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒标准品pMD-gD-IBRV,优化反应体系后,建立了快速检测IBRV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。该方法特异性较强,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法敏感性高,对重组质粒标准品的最低检出限达4.8×10^(0)copies/μL,高于常规PCR方法;批内、批间重复性试验的变异系数均小于2%,表明该方法重复性良好;该方法检测的样本阳性率高于常规PCR方法,利用该方法检测牛场送检的106份临床样品,结果显示IBRV的阳性率为36.7%,常规PCR检测方法检测显示阳性率为33.0%,二者符合率为96.2%,表明该方法更适用于临床样品检测。本研究建立的IBRV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、快速高效,对于IBRV的检测和流行病学调查具有重要意义。

苜蓿矮化病毒实时荧光定量PCR检测体系的建立

为灵敏、快速检测紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中的苜蓿矮化病毒(ADV),根据该病毒L蛋白保守序列设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量PCR检测体系,并应用该方法对田间样品和种子进行快速检测。结果表明,建立的RT-qPCR检测技术可对苜蓿中的苜蓿矮化病毒含量进行精确检测,最低检测浓度为9.8×10^(2)copies/μL,灵敏度约是常规PCR的100倍。通过对101份苜蓿样品的检测验证,该方法阳性检出率为61%,较常规PCR高6%。挑选的10份苜蓿种子中有3份被检测出携带苜蓿矮化病毒,病毒含量范围为0~3.02×10^(6)copies/μL。表明建立的RT-qPCR检测体系特异性强、灵敏度高,可应用于苜蓿矮化病毒的定量检测。

探讨实时荧光定量PCR在乙型肝炎病毒DNA定量检测中应用价值

目的:探讨实时荧光定量PCR在乙型肝炎病毒DNA定量检测中应用价值。方法:选择2021年4月至2023年4月我院收治的120例疑似慢性乙型病毒性肝炎患者为研究对象,分别采用实时荧光定量PCR与酶联免疫吸附法(ELISA)对所有患者HBV-DNA含量进行检测。以试纸法检测结果为标准,比较实时荧光定量PCR、ELISA检测结果的一致性;比较实时荧光定量PCR、ELISA对慢性乙型肝炎的诊断效能;比较不同HBV感染状态下HBV-DNA含量的差异。结果:120例疑似慢性乙型肝炎患者经试纸法检查确诊为慢性乙型肝炎107例。Kappa检验分析结果显示,实时荧光定量PCR检查结果与试纸法检查结果具有高度的一致性(Kappa值=0.897,P<0.05)。实时荧光定量PCR对慢性乙型肝炎的诊断灵敏度、特异性与准确率均高于ELISA(P<0.05)。大三阳HBV-DNA含量均高于小三阳与急慢性感染期(P<0.05);小三阳HBV-DNA含量与急慢性感染期比较无明显差异(P>0.05)。结论:实时荧光定量PCR在慢性乙型肝炎诊断中的应用价值较高,不但能完成疾病的准确诊断,还能通过对乙型肝炎病毒DNA定量检测评估患者病情严重程度,为后续治疗方案的制定与改善提供充足数据支持。

樱桃病毒A实时荧光定量PCR检测技术的建立与应用

在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物(CVA-dF2、CVA-dR2),基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高,无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量,绝对定量标准曲线斜率为-3.5746,决定系数R2为0.9986,扩增效率为0.9044,比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具,可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。

牛冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

针对牛冠状病毒(BCoV)N基因保守序列设计合成了1对特异性引物,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了检测BCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。在1个反应体系中模板最低检测限为7.8 copies/μL,比普通RT-PCR更加灵敏;与牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均无交叉反应;批内、批间重复变异系数均低于1.5%;应用定量PCR检测了39份疑似临床病料,阳性检出率为51.28%(20/39),普通RT-PCR为41.03%(16/39)。结果表明,该方法特异性强、稳定性好、准确率高,本方法将为BCoV的临床诊断和流行病学调查提供技术保障。

外源性马立克氏病病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】为解决现有兽用生物制品外源性马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)检验方法灵敏度低、检测时间长、鉴别性不强的问题,研究分别建立MDV血清1型(MDV serotype 1,MDV 1)和MDV血清3型(MDV serotype 3,MDV 3)毒株的实时荧光定量PCR检测方法,用于禽用生物制品纯净性控制。【方法】从NCBI下载MDV 1、MDV血清2型(MDV serotype 1,MDV 2)和MDV 3各毒株UL19序列,进行核苷酸和氨基酸序列比对分析;分别针对MDV 1 CVI988毒株、MDV 3 FC126毒株的UL19设计特异性引物和相应的Taqman探针,建立实时荧光定量PCR检测方法;分别构建相应的重组质粒作为阳性标准品,建立标准曲线,并评价所建立方法基因拷贝数检测的灵敏度;分别对其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料(SPF鸡胚尿囊液、胚体、尿囊膜、鸡胚成纤维细胞)进行检测,评价检测方法的特异性;分别对600、60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006 PFU的CVI988毒株和FC126毒株进行检测,评价所建立方法检测活病毒粒子的灵敏度;分别以不同稀释度的阳性标准品质粒为模板,进行3次重复性检测,计算变异系数,分析所建立检测方法的可重复性。【结果】MDV UL19在同一血清型内核苷酸和推导的氨基酸同源性达99.99%,具有很高的保守性,在不同血清型间核苷酸同源性只有约75%,推导的氨基酸同源性只有约85%;分别建立了MDV 1和MDV 3两种实时荧光定量PCR检测方法;MDV 1检测方法标准曲线的扩增效率E=98.8%,相关系数R^(2)=0.992,标准曲线方程Y=-3.351X+38.828(Y=Ct,X=lg(拷贝数)),MDV 3检测方法标准曲线的扩增效率E=95.0%,相关系数R^(2)=0.998,标准曲线方程Y=-3.447X+36.496(Y=Ct,X=lg(拷贝数));所建立的两种检测方法特异性好,MDV 1或MDV 3毒株扩增曲线良好,其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料未出现特异性扩增曲线;灵敏度高,MDV 1基因拷贝数检出限度为32.8拷贝/μL,至少可检出0.006 PFU的CVI988毒株,MDV 3基因拷贝数检出限度为10拷贝/μL,至少可检出0.006 PFU的FC126毒株;重复性好,MDV 1检测方法重复性试验的变异系数小于1%,MDV 3检测方法重复性试验的变异系数小于1.5%。【结论】所建立的实时荧光定量PCR检测方法可分别用于禽用生物制品中外源性MDV1、MDV3毒株的检测。

锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

研究建立并完善了Taqman实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的方法。首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列(GenBank AB182940),利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针。其中Taqman探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为:Ct=-3.45 lgX+42.73(相关系数R2=0.989)。通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性。实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求。

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′端非编码区核苷酸序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BVDV的实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法只能检测到BVDV,而与CSFV、BRV、MT及IBRV没有交叉反应,具有高度的特异性,在1010~102模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.991,最低可检测到100个拷贝的阳性质粒。所建立的BVDV实时荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、灵敏等特点。

Taq Man实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成引物和探针,优化反应条件,建立实时定量荧光PCR方法。实验结果表明,当50pmol/L的引物0.3μL和5pmol/L的探针0.5μL时,反应体系获得的CT值较小,而荧光强度增加值最大;制作的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系;可检测到相当于20拷贝/μL的病毒DNA;与猪细小病毒、圆环病毒和猪瘟病毒等不发生交叉反应;敏感性比常规PCR电泳检测高约100倍。该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。

牛诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛诺如病毒(BNoV)是国内新发的犊牛腹泻病原,笔者拟建立检测BNoV的Real-time PCR方法。根据BNoV流行株的RNA聚合酶(RdRp)基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BNoV的Real-time PCR方法。该检测方法的Ct值与标准品模板在2.24×102~2.24×108拷贝·μL-1线性关系良好,相关系数R2=0.997,扩增效率为98.44%;该方法可特异性检出BNoV,对其他犊牛腹泻相关病原呈阴性;最低检测限为22.4拷贝·μL-1;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月—2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本中BNoV的检出率为11.31%(25/221),采样场阳性率为92.86%(13/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BNoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。

建兰花叶病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)是引起兰科植物病毒病的最重要病原体。研究根据NCBI上已登录的CyMV外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因保守区设计两对特异性引物,用RT-PCR法从感病蝴蝶兰中克隆到2条CyMV CP基因序列,编码区ORF长672 bp,编码223个氨基酸。序列分析表明这两个分离物之间有13个核苷酸差异,与已报道的其他地区CyMV分离物CP基因核苷酸相似性分别为97%~99%和97%~98%,氨基酸相似性分别为95%~99%和96%~100%。运用实时荧光定量RT-q PCR法对该病毒检测方法进行了一系列条件优化,建立起一套基于SYBR Green I的CyMV实时荧光定量PCR检测体系。该检测方法比普通RT-PCR法灵敏度高100倍,标准曲线循环阈值(Ct)与模板浓度的对数呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998。重复性试验表明组内及组间变异系数均在2.58%以内,表明该方法重复性较好,可为兰花CyMV的早期预警及病毒在植物体内侵染途径研究提供技术支持。