新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】当前,新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)导致的疫情在全球大流行,严重危害人类的生命健康。研究拟制备并鉴定针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)的单克隆抗体,为SARS-CoV-2新型快速检测方法的创制奠定基础。【方法】纯化原核表达的SARS-CoV-2 N重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,经过4次免疫后将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,并通过western blot和间接免疫荧光试验鉴定抗体的反应性。【结果】经3次亚克隆,试验获得了2株能够稳定分泌抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2D11和8G6;并且制备的抗体与真核表达的SARS-CoV-2 N蛋白反应原性良好。【结论】研究制备的单克隆抗体能够用于SARS-CoV-2的检测。

新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的制备新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。方法根据公布的新冠病毒全基因组序列,构建其核衣壳蛋白的表达载体pET-28a-N,并转化至EscherichiacoliBL21(DE3)进行原核表达,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及Western blot鉴定纯化后的核衣壳蛋白重组抗原的特异性,并免疫Balb/c系小鼠,基于杂交瘤融合技术筛选获得可持续分泌新冠病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的细胞株,并基于ELISA及生物膜层干涉(biofilm layer interference,BLI)技术鉴定单克隆抗体的特异性和亲和力。结果基于大肠杆菌原核表达获得新冠病毒核衣壳蛋白的重组抗原,其纯度可达90%,筛选获得7株可分泌特异性结合新冠病毒核衣壳蛋白的杂交瘤细胞株,经Western blot、ELISA及分子相互作用分析等方法证实所获得的单克隆抗体与核衣壳蛋白具有优良的结合特异性和结合活性,其中的7E11、7E8单克隆抗体与核衣壳蛋白抗原的亲和力常数分别为1.69×10^(-9)、2.031×10^(-9)mol/L,可作为抗体元件应用于新冠病毒的快速免疫分析领域。结论本研究获得高特异性的SARS-CoV-2核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体。

基于荧光纳米粒子的新型冠状病毒核衣壳蛋白免疫层析快速检测试剂的研制

目的:建立新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原快速检测试剂的制备方法,并对检测试剂的性能指标进行评价。方法:以羧基荧光纳米粒子标记的羊抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白(NP)多克隆抗体及鸡IgY为标记抗体,硝酸纤维素膜上分别包被鼠抗N蛋白单克隆抗体和羊抗鸡IgY抗体作为检测线和质控线制备免疫荧光试纸条,对试剂最低检出限、交叉反应性、重复性、临床诊断灵敏度和特异性进行性能评价。结果:检测N全长重组蛋白及热灭活培养物的最低检出限分别为13.8 pg/ml和1.6×10^(2) TCID_(50)/ml;测试16种常见呼吸道病原体高浓度样本均无交叉反应;高、低两个浓度参考品变异系数(CV)分别为7.68%和4.98%。临床鼻咽拭子样本及健康人群鼻拭子样本测试,诊断灵敏度为86.36%(19/22),特异度为99.16%(355/358),总符合率为98.42%(374/380);一致性检验Kappa值为0.8553(P<0.05)。结论:SARS-CoV-2荧光抗原检测试剂检测灵敏度和特异性高,检测速度快,操作便携,可作为现有核酸检测法的补充手段,用于新型冠状病毒的早期筛查。

新型冠状病毒核衣壳蛋白生物信息学分析

目的探讨新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)的生物学特征,为新型冠状病毒肺炎的防控提供依据。方法在NCBI数据库获取N蛋白序列,利用ExPASy分析N蛋白的理化性质和亲疏水性;利用DisPhos分析N蛋白磷酸化位点;利用TMHMM、SignalP和cNLS分析N蛋白的跨膜结构、信号肽和核定位信号;利用SOPMA和Phyre2分别构建N蛋白的二级结构和三级结构;利用NetMHCIIpan、NetCTL和ABCpred分析辅助性T细胞、杀伤性T细胞、B细胞抗原识别位点;利用PredictProtein分析N蛋白的二硫键、亚细胞定位和RNA结合位点。结果N蛋白由419个氨基酸组成。N蛋白分子式为C1971H3137N607O627S7,等电点为10.07,无跨膜结构无信号肽,含有13个磷酸化位点,含2个核定位信号,主要分布于细胞核。二级结构以无规卷曲和α螺旋为主,并获得三级结构模型。N蛋白含有多个辅助性T细胞、细胞毒性T淋巴细胞和B淋巴细胞抗原识别表位,含有多个DNA和RNA结合位点,35-98和255-277位氨基酸区域可能与新型冠状病毒基因组RNA结合。结论利用生物信息学对N蛋白的理化性质、结构、抗原表位、结合位点进行了预测,为更深刻的了解新型冠状病毒的特征提供线索。

基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。

新型冠状病毒Nsp1基因真核表达载体的构建及对宿主蛋白质翻译的影响

非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成功构建SARS-CoV-2Nsp1基因的真核表达载体,并验证其抑制宿主及外源蛋白质翻译的功能。通过PCR技术扩增SARS-CoV-2Nsp1基因后,利用同源重组技术将其连接至pEGFP-N1载体上。经双酶切和测序结果鉴定,SARS-CoV-2Nsp1基因成功克隆至pEGFP-N1载体上。将重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1转染至HEK-293T细胞和HeLa细胞中,经嘌呤霉素标记后,利用Western Blot和考马斯亮蓝染色检测重组质粒的表达以及嘌呤霉素信号。结果表明,重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1在HEK-293T细胞和HeLa细胞中成功表达,并验证其抑制宿主蛋白质和外源转入细胞蛋白质的翻译,为更深入研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的功能奠定基础。

人附睾蛋白4联合炎性指标对新型冠状病毒肺炎患者重症化的预测价值

目的探讨人附睾蛋白4(HE4)在新型冠状病毒肺炎患者血清中的表达变化及其在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者重症化预测中的应用价值。方法选取144例COVID-19患者作为感染组,50例健康体检者作为对照组,测定所有研究对象入院时血清HE4及C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素6(IL-6)、降钙素原(PCT)、铁蛋白(Fer)等其他炎症标志物的表达水平;将COVID-19患者分为普通型(包括轻型、中型)及重型(包括重型及危重型)患者两组,比较血清HE4及其他炎症指标水平的差异,采用多因素Logistic回归分析探讨重症发生的相关因素,绘制受试者工作特征(ROC)曲线以评价各指标对COVID-19重症的预测价值。结果入院时COVID-19患者血清HE4、CRP、IL-6、PCT、Fer、中性粒细胞与淋巴细胞计数比值(NLR)、补体C3(C3)及补体C4(C4)水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.01)。其中发展为重型的患者起初血清HE4、CRP、IL-6、PCT、Fer、NLR水平均高于普通型患者,差异有统计学意义(P﹤0.05)。多因素Logistic回归模型显示,HE4、CRP、NLR为COVID-19发展为重症的独立危险因素。经ROC曲线分析,HEA、CRP、NLR单独预测COVID-19重症化的曲线下面积(AUC)分别为0.856、0.815、0.781,临界值分别为151 pmol/L、7.89 mg/dL、6.355时,约登指数最大,其中HE4敏感度为91.11%,特异度为67.37%;HE4、CRP、NLR三项指标联合检测AUC为0.890,敏感度为84.09%,特异度为79.76%。结论入院时HE4对COVID-19重症化的预测效能最高,可作为COVID-19重症化预测的潜在生物标志物,HE4与CRP、NLR联合检测对COVID-19重症化预测具有更高的准确度和临床应用价值。

C反应蛋白联合红细胞分布宽度检测对新型冠状病毒肺炎合并呼吸衰竭患者的临床预测价值

目的:探讨C反应蛋白联合红细胞分布宽度检测对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)合并呼吸衰竭患者的临床预测价值。方法:回顾性纳入2022年12月至2023年1月于青岛大学附属医院就诊的COVID-19感染213例患者为研究对象,依据是否发生低氧血症和(或)高碳酸血症分为呼吸衰竭组(45例)和非呼吸衰竭组(168例),收集两组一般临床资料及实验室检查指标,通过单因素及多因素logistic回归分析两组之间的差异,构建受试者工作曲线(receiver operating characteristic, ROC)预测模型。结果:呼吸衰竭组慢性阻塞性肺疾病(COPD)病史、收缩压、白细胞计数、中性粒细胞计数、中性粒细胞计数/淋巴细胞计数(NLR)、红细胞分布宽度(RDW)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6 (IL-6)、淋巴细胞计数、肾小球滤过率比较差异有统计学意义(P < 0.05);经多因素logistic回归分析示RDW (P < 0.05, 95%CI: 1.082, 2.246, OR = 1.559)、CRP (P < 0.05, 95%CI: 1.003, 1.027, OR = 1.015)是COVID-19合并呼吸衰竭患者的独立预测因子。两者联合的AUC为0.728 (95%CI为0.643~0.813,P < 0.01),最佳临界值为0.193,敏感度为78.6%,特异度为63.5%。结论:呼吸衰竭在COVID-19中并不少见,提示不良预后。CRP联合RDW检测有望作为评估新型冠状病毒肺炎合并呼吸衰竭简单易行的预测因子。

新型冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的建立与应用

目的:以新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(PLpro)为靶点,利用荧光共振能量转移(FRET)技术,建立用来筛选PLpro抑制剂的高通量筛选(HTS)模型。方法:通过大肠杆菌原核表达系统进行质粒构建、原核表达、分离纯化,获得高活性PLpro(以FRET检测PLpro生物活性),用的底物为两端被荧光基团Edans与淬灭基团Dabcyl修饰的多肽。通过优化实验条件,建立并评价PLpro抑制剂FRET高通量筛选模型,筛选苗头化合物。结果:利用大肠杆菌原核表达系统成功表达并分离出PLpro,其比活力>3000 U/mg。经过优化实验,确定模型筛选条件:设定HEPES缓冲液(pH 7.0)中NaCl浓度为50 mmol/L,孵育温度为25℃,孵育时间为30 min,PLpro浓度为18μmol/L,底物浓度为2μmol/L。测得Z′因子值为0.74,说明所建模型可用于高通量筛选。通过对天然产物化合物库进行筛选,发现十七烷一烯银杏酸(GA17∶1)对PLpro具有混合型抑制作用且IC50值为15.5μmol/L。结论:成功建立PLpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步确定GA17∶1是一种新型抗PLpro的苗头化合物,该筛选方法对于快速筛选新型冠状病毒PLpro的靶向抑制剂具有十分重要的意义。

猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白的研究进展

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原,PEDV可导致猪的急性腹泻、脱水甚至死亡。PEDV最早在1971年被报道,如今,它已成为引起仔猪腹泻的最常见病原体之一,对我国养猪行业造成极大的经济损失。核衣壳(N)蛋白是PEDV主要的结构蛋白质之一。本文对PEDV N蛋白的核定位信号、生理功能、与宿主细胞互作和检测方法四个方面的研究进展综述,以期能对N蛋白的了解更够更加深入,并为PED防控提供参考作用。

硒蛋白基因在新型冠状病毒感染患者中的表达水平及调控作用

目的探讨硒蛋白基因在新型冠状病毒感染(COVID-19)患者中的表达水平及其可能的调控机制。方法从基因表达综合数据库获取数据集GSE177477,样本由有症状组(n=11)、无症状组(n=18)和健康对照组(n=18)构成。对数据集进行预处理,筛选出与COVID-19相关的差异表达基因,并进行基因本体功能注释和京都基因与基因组百科全书富集分析,建立差异表达硒蛋白基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络,采用多因素Logistic回归分析硒蛋白基因对COVID-19患者是否出现症状的影响。结果与健康对照组比较,有症状的COVID-19患者中GPX1、GPX4、GPX6、DIO2、TXNRD1、SELENOF、SELENOK、SELENOS、SELENOT、SELENOW基因表达均升高,TXNRD2、SELENON基因表达均下降(P均<0.05);无症状的COVID-19患者中GPX2、SELENOI、SELENOO、SELENOS、SELENOT、SELENOW基因表达均升高,SELP基因表达下降(P均<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,GPX1(OR=0.067,95%CI=0.005~0.904,P=0.042)、SELENON(OR=56.663,95%CI=3.114~856.999,P=0.006)基因的异常高表达是有症状COVID-19患者的影响因素,SELP基因的异常高表达是无症状COVID-19患者的危险因素(OR=15.000,95%CI=2.537~88.701,P=0.003)。结论硒蛋白基因的差异表达参与调控COVID-19疾病的发生发展,为COVID-19的预防和治疗提供新的参考依据。

新型冠状病毒感染患者治疗前血清肌钙蛋白水平变化及其预后预测效能

目的 观察新型冠状病毒感染患者治疗前血清肌钙蛋白(cTnI)水平变化,分析其与患者短期预后的相关性,并进一步探讨其预后预测效能。方法 共纳入530例新型冠状病毒感染患者作为观察组,另纳入同期体检健康者265例作为对照组,对比两组治疗前血清cTnI水平。观察组所有患者就诊后根据个体情况接受抗病毒、抗菌、免疫、抗凝等药物治疗,根据治疗7 d内新型冠状病毒感染患者临床结局分为病死组与存活组。比较治疗前两组血清cTnI水平;并采用Logistic回归分析血清cTnI水平与新型冠状病毒感染患者短期预后的相关性。绘制ROC分析血清cTnI对新型冠状病毒感染患者短期预后的预测效能。结果 观察组、对照组血清cTnI水平分别为(0.10±0.02)、(0.07±0.02)μg/L,两组比较,t=19.937,P<0.001。病死组、存活组血清cTnI水平分别为(0.11±0.03)、(0.09±0.02)μg/L,两组比较,t=4.913,P<0.001。治疗前血清cTnI水平与新型冠状病毒感染患者短期预后有关[OR(95%CI) 2.104(1.583~3.742),P<0.001]。血清cTnI预测新型冠状病毒感染短期预后的曲线下面积(AUC)值为0.755,cut-off值0.105μg/L,灵敏度63.0%,特异度78.1%。结论 新型冠状病毒感染患者治疗前血清cTnI水平升高,其与患者短期预后有关,对患者短期预后有一定预测效能。

糖尿病合并新型冠状病毒S蛋白感染小鼠病理生理特征

目的建立糖尿病(DM)合并新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染小鼠模型,研究DM合并SARS-CoV-2感染病程发展中的重要病理生理变化。方法将野生型(WT)小鼠和由细胞角蛋白18基因启动子驱动的人血管紧张素转化酶2受体(K18-hACE2,简称hACE2)的转基因小鼠分别随机分为溶剂对照组、DM组、SARS-CoV-2病毒刺突蛋白感染(S)组以及DM合并S蛋白感染(DM+S)组,每组10~12只。除溶剂对照组及S组外,其余组通过10周高脂饮食后连续3 d ip给予链脲佐菌素(STZ)40 mg·kg^(-1)诱导DM症状,溶剂对照组及S组给予等体积0.1 mol·L^(-1)柠檬酸钠缓冲液。在此基础上,S组及DM+S组小鼠经鼻腔滴入15μg SARS-CoV-2 S蛋白与1 g·L^(-1)聚肌胞苷酸(Poly[I:C])的混合溶液50μL,溶剂对照组滴鼻给予等体积无菌水。在高脂喂养第6周和ip给予STZ 1周后,以口服葡萄糖耐量实验评价小鼠糖耐量水平及胰岛β细胞功能。高脂喂养第6周至ip给予STZ 2周后,每周用血糖仪检测小鼠随机血糖及空腹血糖。DM小鼠S蛋白感染前及感染24,48和120 h后,每组取3只小鼠颌下静脉取血后处死并取肺组织,采用苏木精-伊红染色法观察合并S蛋白感染前后的肺组织病理改变。S组小鼠在感染S蛋白前及感染6,24,48,72和120 h后采血,Luminex液相芯片技术检测小鼠血浆细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、干扰素诱导蛋白10(IP-10)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)水平,ELISA检测血浆硫酸乙酰肝素(HS)水平;将细胞因子水平、HS水平与小鼠感染S蛋白后的肺部病理损伤程度进行Spearman相关性分析。结果STZ合并高脂饮食可诱导小鼠DM样表现,hACE2-DM组随机血糖(P<0.01)和1周后的空腹血糖(P<0.05)均显著高于WT-DM组,且hACE2-DM小鼠胰岛功能损伤程度显著高于WT-DM小鼠(P<0.05)。与DM组相比,DM+S组小鼠均表现出更严重的肺部病理变化,并伴有大量炎症浸润和肺间质增厚。与溶剂对照组相比,S蛋白感染6 h,WT-S组小鼠血浆中促炎细胞因子G-CSF,IL-6和IP-10均显著升高(P<0.01),S蛋白感染24 h,促炎细胞因子IL-17和抗炎细胞因子IL-10均显著升高(P<0.05);S蛋白感染6 h,hACE2-S组血浆中促炎细胞因子IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,G-CSF和IP-10均显著升高(P<0.05,P<0.01);WT-DM+S组和hACE2-DM+S组IL-17分别在S蛋白感染24和6 h显著升高(P<0.01,P<0.05),hACE2-DM+S组IFN-γ和IL-1β延迟至48 h显著升高(P<0.05,P<0.01),MCP-1延迟至72 h显著升高(P<0.05)。与溶剂对照组相比,S蛋白感染6和24 h后,WT-S组血浆中HS水平显著升高(P<0.05,P<0.01),48 h开始降低;同时,与WT-S组相比,感染6 h后,WT-DM+S组HS水平略升高,24 h出现降低;hACE2-S组HS水平于24 h显著升高(P<0.01),且在S蛋白感染24,48和120 h后与WT-S组基本持平;S蛋白感染6,24和48 h后,hACE2-DM+S组血浆HS水平均显著升高(P<0.01,P<0.05),升高持续时间较其S组长。小鼠血浆中IL-1β,IL-10,MCP-1,IP-10,G-CSF以及HS水平与DM+S小鼠肺损伤程度呈正相关(P<0.05,P<0.01)。结论本研究建立的DM合并SARS-CoV-2 S蛋白感染小鼠模型能成功模拟临床患者的部分病理生理特征,主要表现为较单纯感染免疫反应钝化,HS水平升高且持续时间较长。IL-1β,IL-10,MCP-1,IP-10,G-CSF以及HS可能有助于及时了解DM合并SARS-CoV-2感染患者的病程。

猪圆环病毒3型核衣壳蛋白多肽抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

旨在建立检测猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)血清抗体的间接ELISA方法以及摸清广西地区PCV3的流行情况。试验以PCV3的核衣壳蛋白多肽作为包被抗原,通过对包被抗原的最佳工作浓度、血清稀释度、封闭剂、酶标抗体工作浓度及作用时间、底物反应时间,阴性和阳性判断标准,敏感性、特异性及重复性等进行研究,建立了检测PCV3间接ELISA方法。随后,应用建立的方法检测2021—2023年广西地区采集的912份猪血清中PCV3抗体存在的情况。抗原最佳包被量为1.25μg/孔、血清稀释度为1∶800、封闭剂为5%的脱脂奶粉、酶标抗体工作浓度为1∶10000、二抗作用时间为60 min、底物反应时间为15 min。阴性和阳性判断标准OD_(450)≥0.55,为阳性;OD_(450)≤0.48,为阴性;当0.48<OD_(450)<0.55时,为疑似阳性,需对疑似样品再次检测。该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和伪狂犬病(PRV)等病毒抗体无交叉反应。批内与批间重复性试验的变异系数分别低于5%与8%,说明基于PCV3核衣壳蛋白多肽建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、特异性及重复性,检测方法稳定可靠。利用所建立的方法进行血清学调查时发现,广西地区PCV3抗体阳性率达到36.62%,说明广西地区猪群中PCV3的感染率较高,应引起重视。

猫冠状病毒核衣壳蛋白的可溶性表达与多克隆抗体反应性鉴定

为制备猫冠状病毒(feline coronavirus, FCoV)核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白的特异性抗体,本研究将Ⅰ型FCoV(ZJU1709)的N蛋白基因全长c DNA亚克隆到pCold TF原核表达载体上,通过低温诱导表达、镍柱亲和纯化获得可溶性重组N蛋白;进一步以纯化的重组N蛋白为免疫原制备兔多克隆抗血清(多抗血清),再通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、蛋白质印迹法(Western blotting, WB)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)等多种方法对兔多抗血清进行反应性鉴定。结果显示:经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)和低温诱导,成功表达出分子量约为100 kDa的可溶性重组N蛋白,在非变性条件下亲和纯化获得的重组N蛋白质量浓度达到1.4 mg/mL;N蛋白兔多抗血清的ELISA效价可达1×10^(6),与真核表达的重组蛋白Flag-N以及FCoV感染细胞中的N蛋白均具有良好的WB和IFA反应性。交叉反应性结果显示:该多克隆抗体能与α属冠状病毒中不同亚型的FCoV以及犬冠状病毒(canine coronavirus,CCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的N蛋白发生反应,但不与β属冠状病毒中的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2, SARS-CoV-2)和γ属冠状病毒中的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)的N蛋白发生反应。综上所述,以pCold TF原核系统表达的可溶性重组N蛋白具有良好的免疫原性,以该蛋白制备的FCoV N蛋白兔多抗血清能识别多种来自不同物种的α属冠状病毒N蛋白,但与β、γ属冠状病毒N蛋白没有交叉反应性,这为进一步研究FCoV复制机制以及开发高效的抗原和抗体检测技术奠定了基础。

新型冠状病毒刺突蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的 探讨SARS-CoV-2对单核巨噬细胞分泌炎症因子的作用及机制。方法 纳入石家庄市第五医院2020年1月21日至2月10日以及2021年1月3日至1月7日住院的COVID-19确诊患者(病例组)与健康对照者(对照组)各53例,收集病例资料与血常规检测结果。采用SARS-CoV-2刺突蛋白刺激单核巨噬细胞,细胞增殖-毒性检测细胞活力,荧光定量PCR法检测炎症因子IL-6、IL-1β和CCL2与信号通路分子JAK1、STAT1和NF-κB的表达。结果 COVID-19患者的单核细胞比值与中性粒细胞比值高于对照组,而淋巴细胞比值、淋巴细胞计数、嗜酸性粒细胞比值、嗜酸性粒细胞计数与红细胞压积低于对照组。SARS-CoV-2刺突蛋白刺激单核巨噬细胞后,在100ng/ml与300ng/ml的浓度下细胞活力高于对照组(P=0.046),在浓度为500ng/ml时IL-6、IL-1β与CCL2的mRNA表达含量最高(P<0.01,P=0.036,P <0.001),在浓度100ng/ml时JAK1与STAT1的mRNA表达明显升高(P <0.001),在300ng/ml与500ng/ml刺激下,NF-κB表达增高(P<0.001)。结论 COVID-19患者的单核细胞升高,SARS-CoV-2刺突蛋白可能通过JAK1/STAT1信号通路促进单核巨噬细胞分泌炎症因子,在细胞因子风暴中发挥作用。

新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)上,电转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,利用优化后的表达条件大量表达重组蛋白,经亲和层析纯化后通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。利用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot分析抗血清的效价和特异性。PCR鉴定和序列测定结果显示,成功构建了重组载体pGEX-RBD和pET-RBD,在大肠杆菌中实现了GST-RBD和RBD-His融合蛋白的可溶性高效表达。研究获得的多克隆抗体的滴度达到约1∶3000,并具有良好的结合特异性。原核表达的可溶性新型冠状病毒RBD重组蛋白具有良好的免疫原性,为后续制备基因工程抗体奠定了实验基础。

基于刺突蛋白(S)和核衣壳蛋白(N)的冠状病毒进化关系分析

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus),是一种具有球形颗粒和包膜结构的单链RNA病毒。从2003年在中国暴发的重症急性呼吸综合征(SARSCoV),到2012年在沙特出现的中东呼吸综合征(MERS-CoV),再到2019年开始报道的新型冠状病毒感染(2019-nCoV),21世纪冠状病毒已经3次严重危害到人类的健康。对冠状病毒的序列特征与进化关系进行分析对病毒的起源与防控具有重要意义。本研究从GenBank数据库中筛选到30条冠状病毒刺突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)的蛋白序列,用邻接法构建进化树,分析冠状病毒进化关系,并对蛋白保守基序进行了分析。结果显示:2019-nCoV与从云南省的中菊头蝠中检测到的冠状病毒分离株RaTG13进化关系最近,并且与SARS-CoV具有较近的亲缘关系,与其他哺乳类和禽类动物感染的冠状病毒遗传进化关系较远。同时发现,相比S蛋白,N蛋白更适合用于构建冠状病毒进化树。保守基序分析表明:N蛋白中,选择的30个蛋白中有9个只含有2个保守元件,21个成员含有3个保守元件,保守元件在蛋白中的分布相对均匀;S蛋白中,选择的30个蛋白均含有3个保守元件,且集中在C端。本研究结果将为冠状病毒的进化关系及防治措施提供一定的理论依据。

2019新型冠状病毒核衣壳蛋白的表达及在诊断方面的应用

目的对2019新型冠状病毒(2019-novel Coronavirus,2019-nCoV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)进行原核表达、纯化与鉴定,并应用于2019-nCoV血清学诊断。方法合成2019-nCoV NP基因,克隆至pET28a载体中,构建表达质粒,并进行诱导纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、间接ELISA、Western blot(WB)、免疫层析法进行鉴定。优化间接ELISA反应条件,进行血清抗体检测。结果重组NP经镍柱纯化后SDS-PAGE电泳显示相对分子质量约50×10^3,与预期一致;间接ELISA、WB表明其能与2019-nCoV感染患者血清特异性结合;用免疫层析法发现对NP检测限为0.2 ng/ml;间接ELISA检测32份2019-nCoV感染者血清及对照血清,发现二者结果可见明显分群。结论原核表达的NP具有良好的免疫原性,可用于制备血清学诊断试剂。

稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。