一种经microRNA敲低PD-1的新型慢病毒载体在CAR-T细胞中的应用

本研究将microRNA插入EF1α启动子的内含子中,构建携带沉默PD-1基因的miRNA的新型慢病毒载体,并将其应用于CAR-T细胞。通过流式细胞术检测慢病毒载体转导效率和PD-1沉默效率;Westernblotting检测PD-1蛋白表达差异;荧光定量PCR检测microRNA相对表达情况;荧光素酶生物发光法和流式细胞术检测CAR-T细胞的能力。结果显示与U6转录microRNA的载体相比较,将microRNA插入到EF1-α内含子中的病毒载体转导效率更显著,对PD-1的敲低效率均达90%以上,且Westernblotting结果验证了PD-1的敲低效果。另外通过荧光定量PCR,可显示出转导该新型慢病毒载体的Jurkat细胞内microRNA的相对表达量。荧光素酶生物发光法证实了CAR-T细胞针对靶细胞的特异杀伤性,流式细胞术结果表明沉默PD-1的CAR-T细胞相较于正常CAR-T细胞显示出更强的特异性杀伤能力。本研究成功构建了经microRNA敲低PD-1的新型慢病毒载体并验证了其转导效率的优越性,以及基于此载体表达的microRNA可高效地沉默PD-1;且应用此载体的CAR-T细胞能发挥更强的杀伤活性,从而为后续该CAR-T细胞治疗表达PD-L1的肿瘤奠定基础。