1株新型鹅星状病毒的全基因序列分析

为研究新型鹅星状病毒(Novel goose astroviruses,N-GAstV)的遗传进化特征,获得了鹅星状病毒安徽分离株AstV/AHHX的全长基因,为7251 nt。测序分析显示:AstV/AHHX具有典型的新型鹅星状病毒基因组特征。AstV/AHHX与分离株GDZJ37以及山东分离株G538和G576的遗传距离较近;同时与毒株GDZJ37、G538和G576的ORF2氨基酸序列同源性达100%,ORF1a和ORF1b的同源性也有99.6%以上,推测它们由同一毒株演化而来。ORF2氨基酸序列位点分析显示有12高变异位点,分别是第36(Y/S/H)、60(V/I)、224(T/A)、228(A/S/T)、229(P/Q)、289(T/A)、376(T/A)、456(D/E)、540(Q/L)、608(S/T)、610(E/D/G)、614(N/A/T)位氨基酸。其中第224、228、229、608、614位的氨基酸突变可能导致病毒蛋白质的构象及功能发生变化,进而改变病毒的致病能力。

安徽省5株新型鹅星状病毒的分离鉴定与遗传进化分析

为研究近年来引起雏鹅痛风病的新型鹅星状病毒流行毒株的病原学和遗传学特征,于2018—2021年从安徽省疑似感染新型鹅星状病毒的雏鹅中采集病料,使用健康鹅胚进行病毒分离,并对分离到的毒株进行全基因组测序和序列分析。结果表明,共分离鉴定到5例新型鹅星状病毒感染样品,利用鹅胚盲传3代成功分离到5株新型鹅星状病毒,均可在鹅胚上稳定传代,分别将其命名为AHAU2018、DY-19、ZY02、HR2105/2和HR2110/1株。全基因组测序结果表明,5株分离毒株的基因组全长均为7175 nt。系统进化树分析结果表明,5株分离毒株均属于致雏鹅痛风的新型鹅星状病毒,但2019年前的毒株与2019年后的毒株处于不同的进化亚分支上。新型鹅星状病毒在我国已发生变异,出现了新的进化亚分支,但优势基因型是否发生变化还有待进一步研究。

新型鹅星状病毒ORF2蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

【目的】由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus,nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库,获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb,可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原,免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫,第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次,每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后,通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时,分离羊驼外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA,利用巢氏PCR方法扩增重链抗体重链可变区(variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies,VHH)基因,将其构建至pComb噬菌体载体并结合噬菌体展示技术构建nGAstV Nb噬菌体展示文库,计算该文库库容量并分析其多样性。nGAstV作为靶抗原,通过三轮富集淘选初步获得与nGAstV反应的重组噬菌体Nb阳性克隆,将其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表达载体并进行测序分析,将测序成功且序列不同的质粒转染至HEK-293F细胞中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达情况。以nGAstV为靶标抗原,利用间接ELISA方法和Western blot试验对表达成功的Nb进行特异性、反应活性验证,并以nGAstV ORF2蛋白为靶标抗原,利用间接ELISA方法对Nb进行亲和力验证,获得生物学活性较好的Nb。【结果】RT-PCR结果显示,nGAstV增殖成功;Reed-Muench法分析nGAstV滴度达4.38 Log10TCID50/mL。羊驼经5次免疫nGAstV后,通过间接ELISA方法测得其血清中针对nGAstV的抗体效价达到1:64000;利用巢氏PCR方法扩增出VHH并成功构建库容量为3.8×108CFU/mL的nGAstV Nb噬菌体展示文库;遗传进化树分析显示,该噬菌体Nb库多样性良好。三轮富集淘选后,初步获得39株与nGAstV反应的重组噬菌体纳米抗体阳性克隆,其中有25株序列不同;SDS-PAGE鉴定结果显示,共有10株Nb在HEK-293F细胞中表达成功。通过ELISA、Western blot验证进一步获得8株与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb,且1株Nb生物学活性最好。【结论】首次筛选到与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb,为nGAstV的基础研究和检测方法提供材料。

新型鹅星状病毒现地株的分离鉴定

为了解齐齐哈尔地区新型鹅星状病毒(Goose Astrovirus,GAstV)的流行情况,本试验采用从查哈阳农场某养殖场采集的疑似新型鹅星状病毒感染致死的雏鹅肝脾病料,进行病毒分离培养,对获得的病毒尿囊液进行RT-PCR检测、病毒半数致死量测定、血凝性检测及动物回归试验。结果表明:分离到的病毒株能使12日龄鹅胚在144 h内死亡;测定病毒的半数致死量(EID50)为10~3.5;血凝性检测未检测出血凝价;动物回归试验,可复制该病,致使5日龄雏鹅发病死亡;ORF1b基因RT-PCR扩增条带大约为210 bp,与目的条带大小相符;对其进行核苷酸序列比对,与在NCBI上已发表的新型鹅星状病毒核苷酸同源性高达99.64%。说明该分离株为新型鹅星状病毒毒株。

新型鹅星状病毒AHQJ18株的分离鉴定

星状病毒于1975年在肠炎患儿的粪便样品中被首次发现[1],随着时间的推移和检测技术的不断进步,星状病毒的种类、宿主及流行范围相继扩大。目前,星状病毒在全世界不同地区不同种类哺乳动物中的感染非常普遍,并且还能感染各种禽类[2]。星状病毒主要引起感染哺乳动物的肠道疾病,对于感染的禽类,除肠道炎症外,还可引发鸡肾脏疾病,雏鸭的病毒性肝炎等[3-5]。星状病毒为无囊膜的单股正链RNA病毒,基因组变异较大,全长约6.1~7.9 kb,包括5′UTR,3个开放性阅读框(ORF1a、ORF1b和ORF2),3′UTR及多聚腺苷酸(PolyA)尾,不同种星状病毒之间存在基因重组现象。星状病毒基因组的高度变异使其对环境和宿主具有很强的适应能力,甚至可跨种传播,是威胁人类健康和动物养殖业的重要传染病原之一。

新型鹅星状病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

新型鹅星状病毒(goose astrovirus, GoAstV)感染引起的鹅痛风病,是近年严重危害我国养鹅业的传染病之一,给我国养鹅产业造成严重经济损失,快速准确诊断有助于更好地防控该病。为了建立一种鉴定新型GoAstV的一步法RT-PCR方法,根据新型GoAstV ORF2基因序列设计特异性引物,构建质粒标准品,并对引物用量和退火温度等反应体系和条件进行了优化。结果表明,该方法能特异性扩增新型GoAstV 512 bp基因片段,其他鹅常见病毒性病原扩增结果均为阴性,具有较高的特异性。敏感性试验结果提示,最小检测限量达4.54×10^(2)拷贝/μL。此外,该方法重复性良好,应用所建立的方法对新型GoAstV临床样品进行检测,102份鹅泄殖腔拭子的阳性率为46.08%,24份痛风症状患病鹅内脏样本阳性率为91.70%。本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且操作简便、经济、快速,可用于新型GoAstV的临床鉴别诊断和流行病学调查。

新型鹅星状病毒荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种准确快速检测新型鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)的方法,研究以GAstV毒株JS20为模板,根据GAstV的ORF2基因序列设计特异性引物,在构建重组质粒pGEMT-GAstV的基础上,建立了检测GAstV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法。结果显示:阳性对照重组质粒pGEMT-GAstV在1.087×10^(1)~1.087×10^(8)拷贝/μL浓度之间与qRT-PCR的Ct值呈现良好的线性关系;该qRT-PCR对所检测的鸡星状病毒(cASTV)、禽腺病毒(FAdV)、小鹅瘟病毒(GPV)以及鸭坦布苏病毒(DTMUV)均无交叉反应;检测灵敏度为1.087×10^(1)拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于1.6%。利用该q RT-PCR方法对在鹅胚及LMH细胞上繁殖不同代次的JS20病毒载量进行检测发现,JS20在鹅胚上的扩增效率更高,病毒载量可达10^(8)~10^(9)拷贝/mL。对江苏不同地区26份临床样品进行检测发现,该q RT-PCR方法的阳性检出率为73.08%,而普通PCR方法阳性检出率仅为42.30%。结果表明建立的新型GAstV qRT-PCR具有很好的特异性及灵敏度,且在新型GAstV定量分析及临床样品检测诊断中展示了良好的应用前景。

新型鹅星状病毒FJ-NP株的分离鉴定

【目的】确定福建某鹅场雏鹅以痛风为主要病征导致高死亡率的病原。【方法】2019年8月福建省南平市某鹅场暴发一种以痛风为主要特征的疾病,该病在5~20日龄的雏鹅中发病率高达40%,死亡率为80%,对该场采集的3份样品进行实验室检测和病原分离鉴定。【结果】PCR检测结果显示3份样品新型鹅星状病毒均为阳性;细菌分离结果显示,未分离到细菌,排除细菌感染引起;接种11日龄鹅胚未出现死亡,但胚体全身皮肤出现点状出血,肾脏、肺脏均有出血点,对收集尿囊液和组织样品进行PCR检测结果显示只有新型鹅星状病毒阳性,未检测到其他鹅常见病毒,将其命名为FJ-NP;并对分离株部分ORF2基因进行遗传进化分析,结果表明该分离株与安徽(GD AHAU2、AHAU3、AHAU5)、黑龙江(AstV-Goose-2018-HLJ01)和河南(AstV-HN02-Goose-1119-18、AstV-AH02-Goose-0715-18、AstV-HB02-Goose-0310-19、AstV-HN03-Goose-0402-19)株在同一进化分支上,与湖北、北京、福建株亲缘关系较远。【结论】成功分离到了1株新型鹅星状病毒,同时进行ORF2部分基因遗传进化分析,为福建省后续开展新型鹅星状病毒相关研究提供了素材。

新型鹅星状病毒ORF2基因的原核表达及多克隆抗体的制备

以新型鹅星状病毒(goose astrovirus, GAstV)ORF2基因为序列设计1对特异性引物,利用PCR方法进行扩增,将其克隆到原核表达载体pET-30a中,转化DH5α感受态细胞,经酶切鉴定及测序后,获得重组质粒pET30a-ORF2。随后转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白。将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗鹅星状病毒衣壳蛋白的多克隆抗体。结果:成功获得ORF2基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,大小约84 kDa,且均能与His单抗和鹅阳性血清特异反应。制备的多克隆抗体,Western blot检测能与重组蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测也能与新型鹅星状病毒发生特异性反应。本试验结果表明,原核表达的新型鹅星状病毒结构蛋白ORF2及制备的多抗均具有良好的免疫原性和反应原性,为新型鹅星状病毒检测方法的建立及ORF2基因功能研究奠定了基础。

广东地区致雏鹅痛风鹅星状病毒的鉴定及遗传演化分析

为了解广东地区鹅星状病毒(GoAstV)的流行和变异情况,本研究于2019年~2021年从广东清远、广州、江门和汕尾4个地区采集83份疑似患痛风雏鹅的肝脏和肾脏病料样品。制备的组织病理切片结果显示,痛风雏鹅肝脏和肾脏组织出现大量的炎性细胞浸润和细胞坏死,经RT-PCR检测鉴定到其中72份样品为Go AstV阳性。从4个地区各选1份阳性样品对鉴定到的Go Ast V进行全基因组的PCR扩增,结果显示获得4株长度均为7033 bp的Go AstV全基因组序列。采用Meg Align分析的核苷酸同源性结果显示,4株Go Ast V全基因组序列的同源性为98.4%~99.4%,与报道的Go AstV-2参考株全基因组序列的同源性为97.1%~99.7%,而与Go AstV-1全基因组序列的同源性仅为57.3%~57.7%。与其他禽星状病毒相比,Go AstV与火鸡星状病毒2型(TAstV-2)的同源性最高,其全基因组序列同源性约为65.0%~65.3%。Cap蛋白的氨基酸序列分子特征分析结果显示,4个鉴定株Cap蛋白的氨基酸序列均发生了Y^(36)H突变,其中Go Ast V/Guangdong/NH2/2019和Go Ast V/Guangdong/GZ-HOD/2021 Cap蛋白氨基酸序列还发生了E^(456)D等突变。采用MEGA7.0软件构建Go Ast V全基因组和Cap基因的遗传进化树,结果显示Go AstV可划分为Go AstV-1和Go AstV-2两个分支,本研究鉴定到的4株Go Ast V均属于Go AstV-2分支。本研究首次初步揭示了广东地区鹅群Go AstV的流行特点和遗传变异情况,为Go AstV感染的防控和疫苗株的筛选提供参考。

山东部分地区新型鹅星状病毒ORF2基因克隆及遗传进化分析

为了解新型鹅星状病毒(NGAstV)在山东部分地区的流行和变异情况,试验采用临床剖检、组织病理学观察和PCR方法对近期来自山东部分地区的32份病鹅样品进行NGAstV检测,并扩增ORF2基因进行遗传进化分析。结果表明:发病雏鹅心脏、肝脏、肾脏等组织有明显尿酸盐沉积,肾小管上皮细胞变性、坏死,脾脏部分淋巴细胞坏死,淋巴细胞数量减少。PCR检测发现被检样品中共有8份NGAstV阳性,阳性率为25%,扩增并测定其ORF2基因序列后进行遗传进化分析,显示获得的8份毒株与近年来鹅场流行的NGAstV遗传关系最近,氨基酸同源性在98.6%~99.6%之间。说明目前山东部分地区有NGAstv的流行但流行毒株尚未发生明显变异。

我国部分地区新型鹅星状病毒ORF2基因序列及遗传变异分析

为掌握我国新型鹅星状病毒(goose astroviruses,GoAstV)的遗传变异方向,对2019年从我国不同地区发病鹅病料中分离到的10株新型GoAstV,采用PT-PCR技术扩增其ORF2基因,然后进行测序和遗传进化分析。结果显示:分离毒株ORF2基因全长2115 bp,编码705个氨基酸;毒株间核苷酸和氨基酸同源性分别为96.2%~99.9%和96.3%~99.9%;分离毒株与参考毒株Goose/SDPY/1116/17亲缘关系最近,处于同一分支。将分离毒株ORF2氨基酸序列与参考毒株进行比较后发现,该基因编码的衣壳蛋白氨基酸序列有多处位点存在差异,表明当前我国GoAstV流行毒株已发生变异。本研究为后续新型GoAstV的分子生物学特性研究及其疫苗研制提供了参考。

新型鹅星状病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立一种新型鹅星状病毒(New goose astrovirus,NGAstV)的RT-PCR检测方法。【方法】根据ORF2基因序列,利用Oligo 7软件设计并筛选出特异性扩增引物,通过优化扩增条件,建立检测新型鹅星状病毒的RT-PCR方法,对其进行特异性及敏感性检验,并在临床上进行初步应用。【结果】RT-PCR最佳反应体系为:Premix 10μL,ORF2上下游引物浓度10μmol·L^(-1)各1μL,模板3μL,无菌去离子水补足至20μL。最佳反应程序为:94℃2 min;94℃30 s、55℃15 s、72℃15 s,30个循环;72℃10 min。该方法对新型鹅星状病毒能扩增出特异性片段,对其他鹅常见病原无特异性扩增;检测灵敏度为62 fg·μL^(-1)。对45份临床样品进行检测,结果检测出15份阳性样品,阳性率为33.33%。【结论】建立的新型鹅星状病毒RT-PCR方法特异性强、稳定性好,可作为新型鹅星状病毒快速检测和流行病学调查的实用技术。

新型鹅星状病毒致雏鹅痛风及其综合防控

2017年起,我国主要养鹅地区雏鹅群暴发了以关节和内脏器官尿酸盐沉积为特征的雏鹅痛风,相关研究表明引起此次雏鹅痛风的病原是一种新型鹅星状病毒(GoAstV)。近年来,GoAstV在我国雏鹅群广泛流行,给我国养鹅业造成极大损失。本文将从病原学、流行病学、临床症状、病理变化、诊断、疫苗研究进展以及综合防控措施对雏鹅痛风进行阐述,以期为小鹅痛风的防控提供参考。

一例新型鹅星状病毒引起雏鹅痛风的中药治疗

近些年研究表明,雏鹅痛风病主要由新型鹅星状病毒引起,该病毒主要侵害2周龄以内雏鹅。病鹅内脏器官表面和关节腔内有大量的尿酸盐沉积,死亡率最高可达50%,给养鹅业带来严重经济损失。大连某肉鹅养殖场雏鹅出现精神萎靡,食欲不振,剖检症状表现为心脏、肝脏、肺脏表面有白色尿酸盐沉积,肾脏呈花斑肾,输尿管有尿酸盐沉积。通过临床症状和剖检变化,结合实验室PCR诊断初步确诊为新型鹅星状病毒导致的雏鹅痛风,经过纯中药制剂治疗,死亡率得到有效控制。

一株鹅星状病毒变异毒株的基因组特征与致病性分析

旨在研究引起雏鹅痛风的新型鹅星状病毒流行株特征。本试验从安徽省鹅星状病毒阳性雏鹅组织中进行病毒分离,并对分离的毒株进行全基因组测序,随后进行遗传进化分析。结果表明,病毒液接种9~11日龄鹅胚可成功分离到病毒,将其命名为GASTV-ZM株。IFA(indirect immunofluorescence assay)鉴定为阳性。基因组序列分析表明,ZM株鹅星状病毒基因组全长7175nt,ORF2基因核苷酸和氨基酸与2014—2020年间分离毒株的同源性分别为96.7%~98.9%和96.9%~99.0%,ORF2基因编码的氨基酸序列结果显示,3个氨基酸突变位点与以往存在显著差异,ZM株与2016年以来在我国流行的新型鹅星状病毒处于同一进化分支,与2020分离株HNSQ-6株和XT1株同源性较高。本研究为进一步研究该病毒的致病性和致病机理奠定基础。

2种鹅星状病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立能同时快速鉴别新型鹅星状病毒和鹅星状病毒变异株的检测方法,根据新型鹅星状病毒的ORF2基因和鹅星状病毒变异株的ORF1a基因的保守区域序列,设计并合成2对特异性引物。通过优化反应体系及反应条件,建立了能同时检测2种鹅星状病毒的一步法双重RT-PCR检测方法。该方法可同时扩增出新型鹅星状病毒658 bp和鹅星状病毒变异株381 bp的特异性条带,对坦布苏病毒、鹅细小病毒、鹅副黏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、大肠杆菌和沙门菌的扩增结果均为阴性,具有良好的特异性。对新型鹅星状病毒和鹅星状病毒变异株重组质粒的最低检测量分别是1μl 1.71×103拷贝和1μl 1.70×103拷贝,敏感性良好,并且具有良好的重复性。应用该方法对临床采集的雏鹅泄殖腔拭子进行检测,结果显示,124份样品中新型鹅星状病毒阳性率为45.16%,鹅星状病毒变异株阳性率为28.23%,2种鹅星状病毒均为阳性的占11.29%,与单一RT-PCR方法检测结果符合率为100.00%。本研究建立的一步法双重RT-PCR检测方法快速简便,特异性强、灵敏度高,可用于临床样品的鉴别诊断,该方法的建立对2种鹅星状病毒病的流行病学调查和有效防控以及混合感染的致病性研究具有重要意义。

一株MLB1型星状病毒全基因组序列分析

了解我国MLB1型星状病毒基因组特征,为星状病毒腹泻的防控提供基础数据。使用星状病毒通用引物筛查北京市丰台区2017年72份儿童腹泻监测病例标本;扩增MLB星状病毒全基因组序列,采用在线比对、进化、重组等生物学信息学方法分析MLB1的全基因组序列。从72份标本中检出2份1型星状病毒(2.78%)和1份MLB1型星状病毒(MLB1-FT)(1.39%)。MLB1-FT与GenBank已报道的MLB1型星状病毒全基因组相似性为92.51%~98.28%;MLB1-FT的三个ORF区,仅5个位点氨基酸与其他株均不相同。依据其ORF2部分序列的进化分析,MLB1可分为A和B两个组,其中A组可分为a和b亚组,MLB1-FT为A组中的b亚组。未发现MLB1-FT具有重组现象。MLB1-FT具有星状病毒特征性的保守基序,部分保守基序与其他型别星状病毒不一样,为MLB1星状病毒特有。MLB1-FT具备新型星状病毒MLB的典型特征。我国新型星状病毒监测力度较弱,应加强监测。

雏鹅痛风病研究进展

雏鹅痛风病主要由新型鹅星状病毒引起,临床特征为内脏器官和关节有尿酸盐沉积。耐过鹅体重减轻、生长缓慢,易继发细菌感染,给养鹅业造成了巨大的经济损失。文章就近年来对雏鹅痛风病的研究进展进行综述,为该病的后期研究及防控提供依据。