新型核酸染料SYBR-Green在检测基因扩增产物中的应用

目的 :将核酸 SYBR- Green染料应用于端粒酶活性检测和食物中毒致病菌的 PCR- SSCP分析。方法 :采用 TRAP法检测 A5 4 9肺腺癌细胞株、2 93细胞株、HL- 60白血病细胞株端粒酶活性。金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、腊样芽胞杆菌标准株增菌后 ,进行 PCR- SSCP分析。在上述两种检测方法中 ,扩增产物电泳后均采用 SYBR- Green染色。结果 :TRAP- SYBR- Green染色法检测 HL- 60白血病细胞株端粒酶活性的灵敏度可达 15个细胞左右。PCR- SSCP检测常见食物中毒致病菌的敏感性可达 10～ 15个鼠伤寒沙门氏菌细胞。结论 :SYBR- Green染色法用于端粒酶活性的检测和致病菌的 PCR- SSCP分析 ,具有快速、简便、灵敏度高。

新型冠状病毒核酸检测假阳性及假阴性影响因素分析

新型冠状病毒(简称新冠病毒)核酸检测在确诊新冠病毒感染和疫情防控中起重要作用。该文结合工作实践,从检测前、中、后质量控制3个方面分析标本质量、规章制度、人员培训、设备性能、试剂耗材、实验操作及结果判读等多种因素造成假阳性和假阴性结果的原因及应对策略,为探寻提升新冠病毒核酸检测的准确性、多角度优化新冠病毒核酸检测工作提供参考依据。

新型冠状病毒感染核酸/抗原转阴后常见症中医诊断与疗效评价专家共识

部分新冠康复患者在核酸/抗原检测转阴后,仍然存在一系列持续、反复或新发症状,这已成为需要关注的新公共卫生问题。中医药在新冠病毒感染的预防、治疗和康复阶段均发挥了重要作用。为进一步规范临床医生对中医药治疗新冠核酸/抗原转阴后常见症的诊疗行为,特邀请一线临床专家就新冠感染核酸/抗原转阴后常见症的概念、病因病机、临床表现、中医治疗及注意事项等进行讨论,形成专家共识。中医、西医、中西医结合医师在临床实践和研究中可参考本文件。

PDCA循环法在新型冠状病毒核酸检测室内质控中的效果评价

目的评价PDCA循环法对新型冠状病毒核酸检测室内质控管理的应用效果,促进室内质控规范化、标准化和精细化。方法采用回顾性分析对该院2021年3月至2022年8月进行新型冠状病毒核酸检测的室内质控数据进行阶段性分析,分为对照组(2021年3-8月);观察1组[持续改进第1阶段(2021年9月至2022年2月)],较对照组优化了工作制度、室内质控文件体系,增加了质控记录信息化;观察2组[持续改进第2阶段(2022年3-8月)],比较观察1组分类统计不同仪器试剂质控数据并优化了室内质控失控分析流程。比较3组阳性质控失控率、质控记录缺失率、标本复查率、翘尾率及每月统计分析平均耗时。结果对照组:共分析检测3029批次,检测226158管,阳性质控失控率≈0.13%,质控记录缺失率为0.86%,每月统计分析平均耗时约40 min,标本复查率和翘尾率无相关记录;观察1组:共分析检测3530批次,检测214374管,阳性质控失控率为0.82%,质控记录缺失率为0.00%,每月统计分析平均耗时约10 min,标本复查率为0.66%,翘尾率为0.10%;观察2组:共分析检测3550批次,检测203571管,阳性质控失控率为0.14%,质控记录缺失率为0.00%,每月统计分析平均耗时约2 min,标本复查率为0.46%,翘尾率为0.04%。观察1组质控记录缺失率和每月统计分析平均耗时均明显低于对照组,观察2组标本复查率、翘尾率及每月统计分析平均耗时均明显低于观察1组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过PDCA循环法对新型冠状病毒核酸检测室内质控流程持续改进,效果明显。

新型冠状病毒核酸两种混合检测技术的应用结果比较

目的研究在同等实验条件下2019-nCoV核酸混采检测技术(简称混采)与筛查稀释混样检测技术(简称混样)所测核酸结果有无差异,评估应用效果,为合理的选择混合检测技术及最佳混合比例提供参考。方法选取500拷贝/mL、1500拷贝/mL、5000拷贝/mL 3份阳性标本,分别与0份、4份、9份、19份阴性标本混合,制备成相应浓度的混采和混样悬液,使用RT-PCR法检测所有标本,并分析比较检测结果。结果Ct值高低与病毒载量成反比,与混合倍数成正比;混采时相同病毒载量组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05),其中五混采与单混的两两比较,差异均无统计学意义(P>0.05);混样时相同病毒载量组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05);相同混合倍数和病毒载量时,混采Ct值均低于混样,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在低流行区域大量人群筛查时,混采的检测效果明显优于混样,五混采不仅可增加混检人数,且检测结果与单混基本一致,可提高检测效率与能力。

6种新型冠状病毒核酸检测试剂的检测性能对比观察

目的比较6种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疑似患者咽拭子标本中2019-nCoV的检出率及CT值,以评估不同核酸检测试剂的检测性能。方法采用6种2019-nCoV核酸检测试剂[试剂A(上海辉睿生物科技有限公司)、试剂B(上海捷诺生物科技有限公司)、试剂C(上海伯杰医疗科技公司)、试剂D(上海之江生物科技股份有限公司)、试剂E(圣湘生物科技股份有限公司)、试剂F(中山大学达安基因股份有限公司)]、实时荧光RT-PCR法检测47例COVID-19疑似患者咽拭子标本中的2019-nCoV核酸(ORF1ab、N基因),对其中CT值较小的5份咽拭子标本进行10倍、100倍的稀释后,再次检测2019-nCoV核酸的ORF1ab和N基因。结果试剂A、B、C、E、F对2019-nCoV ORF1ab、N基因阳性检出率及CT值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。除了试剂D,试剂A、B、C、E、F均能同时检测出不同稀释浓度2019-nCoV核酸阳性咽拭子标本中ORF1ab和N基因。试剂A、B、C、E、F检测3种浓度2019-nCoV核酸的CT值比较,P均>0.05。结论6种2019-nCoV核酸检测试剂中,试剂A、B、C、E、F对COVID-19疑似患者咽拭子2019-nCoV核酸的检出率差异不大,稳定性均较好;试剂D需进一步优化。

定点医院新型冠状病毒肺炎患者核酸检测工作的实践和探索

目的:探讨现阶段新型冠状病毒(新冠)肺炎患者核酸检测中的相关问题和解决方案,为临床实验室提供参考。方法:选取2022年4月1日至4月10日入院的462例新冠肺炎患者,对其核酸检测基础循环阈值(cycle threshold,Ct值)和时间变化规律进行分析;分析3月20日至3月31日和4月1日至4月10日2个时间段内,因样本采集原因导致的核酸检测结果假阴性的情况。选取213份临床核酸检测样本,采用试剂A和试剂B进行平行检测,比较两者间的差异。根据相关文件,制定可疑样本的复检标准作业程序(standard operation procedure,SOP)文件;制备弱阳性质控品,参考定量试验的质控方法,每天分5批次检测,共4 d,获得20组数据,以此为初始数据制作质控图。结果:462例新冠肺炎患者的ORF1ab和N基因基础Ct值中位数分别为24.50(20.58~32.10)和23.38(19.43~31.24),184例Ct值<30的患者,其Ct值升至30以上所需的中位时间为6(4~8)d。北部院区转型前期和转型后期,采样不合格率分别为12.4%和2.4%,差异具有统计学意义(P<0.01)。2种试剂在新冠核酸检测Ct值<30的样本中一致性较好,但检测Ct值在30~40的样本时,两者一致性降低。自制弱阳性质控品20次检测ORF1ab和N基因Ct值分别为35.17±0.55和35.23±0.88,能较好地监控临床上较为关注的Ct值在35左右的样本检测情况。结论:对于入院基础Ct值<30的新冠肺炎患者,其核酸检测频次可设定为3~4 d进行1次。2种常用新冠核酸检测试剂,在检测Ct值≤30的样本时一致性较好,但检测Ct值在30~40的样本时,两者结果差异明显。建立适用于定点医院实验室的样本复检规范和流程,同时应加强对Ct值处于35左右样品检测的质量监控,以保证实验室新冠核酸检测结果的一致性。

基于FRACAS工具的大规模新型冠状病毒核酸筛查气膜实验室风险管理

目的识别和评估大规模新型冠状病毒核酸筛查气膜实验室的质量风险,并采取措施以消除或降低风险。方法参考CLSI EP18-P2文件,利用故障报告、分析及纠正措施系统(FRACAS)工具对江苏苏州甪直基地大规模新型冠状病毒核酸筛查气膜实验室2022年4—5月运行期间的检验过程进行风险管理。结果在实验室运行过程中,共观察到16个差错事件,其中有5个存在不可接受的风险。进一步分析发现,16个差错事件存在于不同的阶段,涉及的原因共有28条,其中15条与人员有关,5条与环境有关,7条与仪器设备、耗材有关(包含1条与信息系统有关),另有1条与检测流程有关,以上均是影响检验质量的重要环节。采取干预措施后,12个差错事件未再发现,4个差错事件的发生率也降低至100 ppm以下。结论FRACAS工具可以应用于医学检验领域的质量管理,从而有效降低实验室不良事件的发生风险。

多次新型冠状病毒核酸检测阴性新型冠状病毒肺炎的诊断(附1例报告)

目的探讨多次新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测阴性、最终确诊的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者的有效诊断方法。方法回顾性分析1例多次2019-nCoV核酸检测阴性、最终确诊的COVID-19患者的流行病学史、临床表现、血常规、血生化指标、胸部CT影像学检查及2019-nCoV核酸检测结果。结果该COVID-19患者有COVID-19确诊患者明确的接触史,临床表现为间断发热、乏力,血常规提示淋巴细胞绝对数降低及肝功能受损,胸部CT影像学可见双肺散在磨玻璃影,4次2019-nCoV核酸检测阴性,第5次2019-nCoV核酸检测阳性。结论多次2019-nCoV核酸检测阴性的COVID-19患者应该多部位取材,或检测患者血清抗体,以提高诊断准确性。

使用移动微生物检测车远程应急支援新型冠状病毒核酸检测

2021年1月17日,吉林省各医疗机构组建吉林省新型冠状病毒核酸检测队,随同移动微生物检测车支援通化市。本文总结以适应野外环境工作的移动微生物检测车为载体,开展新型冠状病毒核酸检测工作的经验,评估使用移动检测模式应对突发疫情的能力,为未来使用移动微生物检测车远程应急支援新型冠状病毒核酸检测提供参考。

多套仪器组成的新型冠状病毒核酸检测系统的性能验证方案设计

为新型冠状病毒核酸检测实验室提供适用于多台核酸提取仪和多台荧光定量PCR仪组成的检测系统的性能验证方案。本研究以配置4台核酸提取仪和4台荧光定量PCR仪的新型冠状病毒核酸检测系统为例,验证参数包括方法符合率、精密度和检出限,设计出三套性能验证方案。经过对三套性能验证方案的比较分析,笔者认为方案三最优,其方案是首先在1台核酸提取仪上提取核酸,分别在4台荧光定量PCR仪上进行扩增检测,以验证4台荧光定量PCR仪的性能,然后分别在4台核酸提取仪上提取核酸,在同一台荧光定量PCR仪上扩增检测,以验证4台核酸提取仪的性能,达到了16套组合检测系统的验证效果,保证了新型冠状病毒核酸检测的质量,试剂消耗和时间成本适中,可以有效、经济、快速地评估各性能参数是否符合厂商的声明。

江苏省新型冠状病毒核酸检测实验室能力建设调查

目的了解江苏省各级疾病预防控制机构应对新型冠状病毒的实验室能力情况,为优化省、市和区(县)生物安全实验室网络布局、满足新型冠状病毒肺炎等重大疫情防控多层次检测需求提供政策依据。方法根据新型冠状病毒检测所需的实验室仪器、专业技术人员、实验室备案与质量控制等关键指标制定调查表进行调查,并对调查结果进行统计学分析。结果江苏省共有疾病预防控制机构112家,配备生物安全实验室124个,核酸提取、定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪器分别为85和112台,核酸检测专业人员有249人,仅有29个实验室完成PCR备案,全省每日最大检测样本数为5236个,占理论值的74.0%。结论江苏省新冠病毒核酸检测相关的实验室能力尚不均衡。省、市两级生物安全实验室能力建设较好,区(县)级较为薄弱,区(县)级疾病预防控制机构普遍存在仪器设备配备不足和检测人员缺乏等问题,具备核酸检测能力的机构较少;区域资源配置不均衡,苏北地区硬件设施和人员配置相对不足,具备核酸检测能力的机构较少;全省疾病预防控制机构的实验室均存在PCR备案和质量控制管理不完善的问题。

金黄色葡萄球菌新型耐热核酸酶(Nuc2)的定点突变与特性分析

本研究选取了F60、A62、T102和Y135这4个可能的关键位点,采用定点突变的方法成功构建了5个Nuc2的单点和多点突变体。体外表达并纯化这些核酸酶,对其活性、耐热性和二级结构进行测定。结果表明:经方差分析(p<0.05),T102M和F60A/A62L/T102M/Y135V的核酸酶活性与野生型相比较显著下降,并且F60A/A62L/T102M/Y135V的酶活性基本丧失;T102M和F60A/A62L的耐热性明显弱于野生型;T102M和F60V/A62L的二级结构中α-螺旋结构的含量明显低于野生型,F60A/A62L/T102M/Y135V的二级结构中包含有无规卷曲。因此,推断T102是维持Nuc2核酸酶活性、耐热性和二级结构稳定的一个关键位点;F60、A62、T102和Y135及其与邻近氨基酸之间的相互作用对维持Nuc2的性质稳定起着重要作用。

医学检验实验室在区域新型冠状病毒核酸检测中的质量监管

目的:保证本市区域新型冠状病毒(新冠)核酸检测医学检验实验室的检测质量。方法:自2022年3月~5月,通过月度检查、蹲点督查、应急督查、盲样调查、留样再测等方法,加强对本市新冠病毒核酸检测的质量监管。结果:区域新冠核酸检测医学检验实验室在人员资质、业务培训、室内质量控制、结果判断、复检流程、报告上传、清洁消毒和医疗废物(医废)处理等方面存在不合格情况。开展新冠核酸检测实验室从3月18日疫情初期的29个,逐渐扩展到5月16日的98个,但不合格实验室数未明显增多。本市医学检验实验室盲样调查合格率为96.6%~100.0%,实验室留样再测结果与留样检测机构结果一致率为98.3%~100.0%。结论:本市区域新冠病毒核酸检测质量可控,没有发现系统性质量问题。多种措施并举的质量监管模式值得在区域新冠核酸检测质量监管中推广应用。

分子诊断技术在新型冠状病毒核酸检测中的应用及发展

新冠肺炎疫情是百年来全球发生的最严重的公共卫生事件,其持续爆发凸显了快速准确的诊断分析是大流行得到控制的密钥。该文结合新型冠状病毒核酸检测现状和当前最新标准指南,对不同分子诊断技术进行评述,并对这些技术在未来传染病暴发中的应用和发展提出建议。

益气解毒方治疗新型冠状病毒肺炎的临床研究

目的:探讨益气解毒方治疗新型冠状病毒肺炎的临床疗效。方法:选取医院2022年1~9月收治的60例新冠肺炎患者,按随机数字表法分为治疗组与对照组,各30例。治疗组给予益气解毒方治疗,对照组给予西医对症治疗。观察两组新型冠状病毒核酸QRF1ab基因及N基因Ct值变化情况、平均住院天数、平均住院费用、中医证候积分、治疗总有效率及不良反应发生情况。结果:治疗后,两组新型冠状病毒核酸QRF1ab基因及N基因Ct值均显著提高,且治疗组优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,治疗组平均住院天数明显减少,平均住院费用明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,两组中医证候积分均低于治疗前,且治疗组更低,差异有统计学意义(P<0.05);治疗组治疗总有效率高于对照组(P<0.05);治疗组不良反应发生率低于对照组(P<0.05)。结论:益气解毒方治疗新型冠状病毒肺炎疗效显著,可提升新型冠状病毒核酸QRF1ab基因及N基因Ct值,缩短治疗周期,减少住院费用,改善临床症状,不良反应发生率低。

新型冠状病毒核酸检测实验室设计要点分析

一场突如其来的新型冠状病毒感染的肺炎疫情对传统的检测实验室挑战巨大,提出了新型冠状病毒核酸检测实验室与传统的核酸检测实验室的区别以及新型冠状病毒核酸检测实验室平面布局、通风空调、电气通信以及对废弃污物处理的设计要点,供相应建设单位和设计同行参考。

不同新冠病毒核酸检测系统结果一致性的验证及分析评价

目的:对两种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测系统的结果一致性进行验证,分析评价两种检测系统的新冠病毒核酸检测能力及生物安全风险。方法:2022年10月—12月于新型冠状病毒感染样本菌毒种库中随机抽取确诊病例和排除病例的灭活鼻咽拭子标本,共计20份。采用盲法随机编号,同时使用珀金埃尔默(PerkinElmer)explorer G3病原体核酸提取检测系统和传统ABI QuantStudio Dx实时荧光定量PCR相关检测系统进行平行检测,通过配对定量资料的t检验比较两种系统检测靶基因的原始Ct值有无差异;通过Kappa一致性检验对两种检测系统阴阳性结果整理成的配对设计四格表数据进行分析。结果:检测结果数据锁定后揭盲,两种系统检测20份新冠病毒样本的靶基因(ORF1ab和N基因)原始Ct值差异无统计学意义(t值分别为0.446和0.291,P值都大于0.05);结果判定后其中16例新冠病毒感染确诊病例鼻咽拭子检测结果均为阳性,4例排除病例鼻咽拭子检测结果均为阴性,Kappa系数=1,两种系统检测结果的一致性非常好。结论:珀金埃尔默explorer G3病原体核酸提取检测系统和传统ABI QuantStudio Dx实时荧光定量PCR相关检测系统在新冠病毒核酸检测中结果一致,都具有良好的精确度和准确性。前者通过自动化和标准化工作流程和操作步骤,迅速提升了实验室病毒检测能力,有效降低了人工干预产生的污染和继发感染风险,是未来发展的趋势;后者手工操作过程需要进行大量精细操作,生物安全风险较大,在样本量较少的情况下,可基本满足实验室需要,可用于自动化核酸提取系统检测结果的复核检测。

核酸染料的应用研究进展

核酸染色是核酸研究的重要组成部分,溴化乙锭(EB)是核酸研究中常用的染料,因其自身存在的缺点,目前研究者正不断推出新的核酸染料,以期能找到可完全取代EB用于常规核酸染色的新型染料.本文对EB及近年新推出的一些新型核酸染料的特点进行了总结,并比较了它们的优缺点,为研究中选用何种染料进行核酸染色提供参考.

新型分子信标技术的研究进展

分子信标是一种设计巧妙的新型荧光标记核酸探针。特殊的发夹结构使分子信标具有很强的特异性识别靶标序列的能力,目前已成为生物学中一种强有力的研究工具。本文介绍了近年来出现的各种新型的分子信标(MB)的结构及工作原理。简要概述了MB技术在生命科学领域中的应用,展望了MB技术的发展趋势。