新型猪源H1N1流感病毒的分离鉴定及在实验条件下气源性传播的特点

新型猪源性H1N1流感病毒能引起人和猪的呼吸道传染性疾病,自2009年4月起在全球范围内暴发,引起广泛的关注和研究,本试验拟对其分离株的气源性传播特点进行研究。2011年1月,华东某地区出现流感疫情,本研究从病死猪的鼻腔棉拭子和肺脏中分离到1株新型猪源性H1N1流感病毒A/swine/Shandong/07/2011;用荧光定量PCR方法检测发病猪场舍内、外的空气样品中病毒含量;建立气溶胶传染模型来分析该株病毒在实验条件下气源性传播的特点。结果显示:猪舍内空气样品的阳性率为26.10%,病毒含量在3.14～5.72log10copies.m-3空气之间;舍外下风向10m处空气样品的阳性率为40.70%,病毒含量在2.24～3.77log10copies.m-3空气之间;在传染模型中,A/swine/Shandong/07/2011能够造成气溶胶感染组试验猪的感染,但感染率比直接接触组低。研究表明,A/swine/Shandong/07/2011株具有形成病毒气溶胶的能力,在实验条件下能够引起气源性感染。

一株新型三源重配H1N2亚型猪流感病毒的进化分析及对小鼠的感染性研究

为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分子进化分析,结果显示其8个节段均与2015年~2016年在美国分离的H1N2亚型SIV有高度同源性(98.9%~99.7%),其中HA基因可能来自于2009年之前的人季节性H1N1亚型流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、NA和NS可能来自北美三重配H1N2亚型SIV,M基因可能来自H1N1/2009。以106 EID50 SIV GX238株病毒鼻腔感染BALB/c小鼠后记录小鼠的体质量变化及死亡情况,感染后第3 d检测小鼠各脏器病毒复制情况。结果显示,感染组小鼠体质量与PBS对照组小鼠相比有明显下降趋势,感染小鼠40%死亡;在小鼠肺脏和鼻甲中病毒滴度分别达6.3 Log10EID50/mL、4.8 Log10EID50/mL,表明该病毒对小鼠表现出中等的致病力。本研究结果表明输入型SIV持续对我国猪群造成威胁,凸显了在世界范围内开展猪流感监测的必要性。

一株人源H1N1亚型猪流感病毒的进化分析与生物学特性研究

为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到一株猪流感病毒,通过RT-PCR和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型,命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1),其全基因序列测定及同源性分析发现,8个基因片段均与2000年左右H1N1人流感病毒有较高的同源性。系统遗传演化显示,该病毒分离株是由2000年人源H1N1流感病毒A/Dunedin/2/2000(H1N1)进化而来。抗原性分析显示该株与甲型H1N1流感病毒和经典H1N1病毒株抗原性差异较大。对小鼠致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠并导致小鼠轻微临床症状和组织病理学变化,但不致死小鼠,表现为低致病性。

新的猪源性甲型H1N1流感病毒

2009年3月在美国和墨西哥流感样患者的呼吸道标本中鉴定出新的猪源性甲型H1N1流感病毒。该病毒可人-人传播,已蔓延到172个国家和地区。现就猪源性甲型H1N1流感病毒的鉴定、基因组结构特征做一综述。

猪源性甲型H1N1流感病毒研究概况

2009年3月在美国和墨西哥流感样患者的呼吸道标本中鉴定出新的猪源性甲型H1N1流感病毒。该病毒可人-人传播,已蔓延到112个国家和地区。为了遏制不断重组或重配的流感病毒,各国学者对甲型H1N1流感病毒的分子生物学特征、复制周期及实验室诊断做了细致的研究,以研发相应的药物或疫苗,这些成就为世界各国防控今年新鉴定的猪源性甲型H1N1流感病毒感染发挥了重要作用。现就猪源性甲型H1N1流感病毒的鉴定、基因组结构特征做一综述。

猪源新型甲型H1N1流感病毒的分离鉴定及遗传进化特点

本研究旨在了解猪源新型甲型H1N1流感病毒山东分离株的遗传进化特点。对山东地区出现的疑似H1N1流感病死猪进行病料采样,然后进行病毒的分离鉴定,并对分离病毒株(A/swine/Shandong/07/2011)的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、NS和M基因进行遗传进化分析。结果显示,该株病毒8个片段的核酸序列与A/H1N1(2009)对应序列的相似性都大于99%,并且该毒株HA蛋白的裂解位点和优先识别唾液酸α-2,6受体的位点与A/H1N1(2009)也高度一致,分别为PSIQSR↓GLFGAI和190D、225D。但是,与A/H1N1(2009)毒株的HA蛋白相比,受体结合位点处出现了重要的突变(Q226R)。该研究结果为进一步研究猪源新型甲型H1N1流感病毒的分子进化提供了重要信息。

H1N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/06分离鉴定和对猪致病性研究

2006年5月从广东某大型猪场采集具有流感症状保育猪鼻拭子共98份,无菌常规处理猪鼻拭子后接种MDCK细胞,分离到4株流感病毒。用血凝抑制和PCR方法鉴定均为H1N2亚型。挑选其中一株A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2),进行全基因组测序,并与GenBank中相关序列进行比较。核苷酸同源性分析表明:A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2)与A/Swine/Guangxi/13/06不同基因之间同源性为96.6%～98.1%。以106EID50的剂量,将H1N2病毒鼻腔感染35日龄仔猪,结果表明H1N2亚型流感病毒可以感染猪上呼吸道,但不表现临床症状。本研究结果对于揭示H1N2亚型猪流感流行规律和病毒的致病机理具有一定的意义。

重症甲型H1N1猪源性流感诱导溶血性尿毒症1例

患者男，20岁，症状出现前健康，无特殊医学史，自述患病前未接触猪与甲型H1N1流感患者。因干咳、腰痛、发热．到医院就诊，体温38℃，检查显示：血小板：60×10^9／L、丙氨酸氨基转移酶118．9U／L，尿素氮14．6mmol／L，肌酐240．4μmol／L：尿常规：尿蛋白（＋＋），血红蛋白（＋＋＋），尿量700mL／d。采用RT．PCR技术检查该患者鼻拭子．结果为甲型H1N1猪源性流感病毒阳性。后转入山东省胸科医院东院区呼吸重症监护室接受治疗。

一株H1N1亚型猪流感病毒全基因组序列分析以及生物学特性研究

本实验室于2016年在江西分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Jiangxi/261/2016(H1N1),为进一步弄清该株流感病毒的遗传进化背景和生物学特点,本研究对其进行了全基因组测序,遗传进化分析,BALB/c小鼠致病性试验,抗原性差异试验,受体结合特性试验。测序结果显示该病毒HA碱性裂解位点仅具有一个碱性氨基酸,符合低致病性流感病毒特点。外部基因来自欧亚类禽,内部基因来自2009/H1N1(PB2、PB1、PA、NP),欧亚类禽(M)和Triplereassortant H1N2(NS)。10~6 EID_(50)/50μL剂量可感染小鼠并致死,HA抗原性差异试验结果显示其与欧亚类禽Group1代表株差异较小,受体结合试验结果显示该病毒株主要结合α-2,6唾液酸受体。其传播性和致病性增强机理还有待进一步研究,本实验结果为SIV的检测和防控提供借鉴意义。

一株重配型H1N2猪流感病毒的进化分析及对小鼠的致病性

为了进一步了解我国辽宁省猪流感(SI)的流行情况及病原的进化规律,对2016年年末在辽宁省某生猪屠宰场进行SI病原学监测时分离到的一株H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Liaoning/FX575/2016(简称FX575)进行全基因组序列测定,通过对其8个基因片段的基因来源进行分析,确定基因型;构建系统进化树;分析相关分子特征;进一步以6周龄雌性BALB/c小鼠为感染模型,通过测定感染后小鼠的体重变化和脏器病毒含量评估病毒的致病性。结果显示:FX575为一株三重重配型的H1N2病毒,遗传进化分析结果显示病毒的HA基因来自于欧亚类禽型H1N1(EA H1N1)分支的SIV,NA基因来自于北美三重配型H1N2分支的SIV,6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)均来自于2009/H1N1分支的病毒。以10~6EID_(50)的剂量经鼻腔途径感染小鼠后,能够引起小鼠出现明显的体重下降,其中有1只小鼠在感染后第7天体重下降的比率超过25%,判为死亡;感染后第3天在小鼠肺及鼻甲骨中均检测到较高滴度的病毒,含量分别为4.82、4.20 log_(10)EID_(50)·mL^(-1)。结果表明SIV在不断流行的过程中,不同基因型病毒之间发生重组导致出现基因三重配的病毒,病毒对小鼠呈现中等致病力特征,提示应进一步加强对SI的主动监测,从而降低病毒对兽医及公共卫生学风险。

两株H1N1亚型重组流感病毒的猪致病性研究

选取2种不同宿主来源的新型甲型重组H1N1亚型流感病毒(犬流感病毒(A/canine/Guangxi/QZ5/2013)(简称CIV-QZ5)和猪流感病毒(A/swine/Guangxi/QZ5/2014)(简称SIV-QZ5),以猪为动物模型,分别以106 PFU/mL病毒剂量和气管攻毒的方式感染3周龄仔猪,从而探究新型甲型重组犬流感病毒对猪的致病性。试验发现CIV-QZ5及SIV-QZ5均能有效感染仔猪,攻毒仔猪均出现发热(≥39.5℃)、流鼻涕、食欲减退、活动减少等流感症状,其中CIV组出现1头仔猪(A3)死亡。通过对肺脏灌洗液进行病毒滴定,发现CIV组在攻毒后3d和5d在肺脏的复制能力较SIV组强,最高达到3.12log10PFU/mL。病理剖检发现,肺脏出现不同程度的实变。肺脏病理切片发现两组均出现不同病变,其中以死亡仔猪(A3)最为明显,主要以支气管上皮细胞坏死脱落,肺泡壁增厚,肺泡腔以及支气管内有大量的弥漫性浸润的单核细胞为主要特征。结果表明,猪源甲型重组CIV不仅能引发猪出现明显流感症状,而且能有效地在肺脏复制,为了解潜在的猪-犬跨宿主传播机制奠定了基础。

欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件：抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1：200,封闭时间为1 h,一抗血清最佳作用时间为2 h,酶标二抗最佳稀释度为1：40 000,二抗最佳作用时间为1 h,TMB显色时间为7 min。阴/阳性血清的判断结果分别为OD450≤0.255和OD450≥0.292,介于两者之间为可疑。符合性试验结果显示,建立的间接ELISA方法与血凝抑制（haemagglutination inhibition,HI）检测的阳性率分别为53.27%和49.53%,两者总复合率达96.27%。特异性试验结果显示,该方法与古典H1N1亚型和H3N2亚型猪流感阳性血清无交叉反应。通过重复性试验表明,同一批制备的重组蛋白包被96孔酶标板,检测OD450值的批内变异系数为1.97%-7.85%,批间变异系数为1.94%-6.93%。总之,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA方法,具有敏感性较高、特异性强、重复性好的特点,为猪流感抗体检测提供了一种准确、快捷、简便、有效的技术手段,可用于禽源H1N1亚型猪流感抗体检测和流行病学调查。

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及小鼠致病性的研究

为了初步了解从江苏某屠宰场分离鉴定出的一株猪源H1N1亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Jiangsu/1070/2019(H1N1)的6致病性,对该分离株纯化后进行全基因序列分析,测定其生物学特性,并以10 EID50病毒感染BALB/c小鼠。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点为339PSIQSR↓G347,符合低致病性SIV的分子特征,与A/Swine/Jiangsu/J006/2018(H1N1)同源性最高达到98.94%,NA基因与A/Swine/Shandong/LY142/2017(H1N1)同源性最高达到98.79%,内部基因PB2、PB1、PA、M、NP和NS分别与2018年出现的不同猪源H1N1亚型具有高同源性,因此该病毒是一株在猪体内重组的病毒;病毒在鸡胚上的半数感染量(EID50)为10-8.5/0.1 mL,在MDCK细胞上的半数感染量(TCID50)为10-5.22/0.1 mL;小鼠致病性结果显示,该病毒除可导致小鼠体重下降外,还具有致死小鼠的能力,小鼠的致死率约为33.3%,其能够在小鼠的肺脏和心脏中复制,滴度分布达到2.91±0.19 lg EID50/mL和2.37±0.29 lg EID50/mL,感染后可造成小鼠肺部组织发生严重炎性反应,并导致炎性相关细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的表达水平明显上调(P<0.01)。综上表明该毒株为新型重组病毒,对小鼠具有一定致病性,为H1N1亚型猪流感的预警和防控提供一定的参考依据。

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解广东地区猪流感的流行和变异情况,本研究于2013年11月~12月从广东省5个猪场中采集疑似流感症状的猪鼻拭子115份,接种10日龄SPF鸡胚,分离得到一株猪流感病毒（SIV）,对其进行血凝和血凝抑制试验、RT-PCR检测及全基因测序分析,结果表明该分离株为H1N1亚型,将其命名为A/Swine/Guangdong/L2/2013（H1N1）。HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR↓GL,具有典型的低致病性流感病毒特征。系统遗传进化分析显示,该病毒与A/swine/Shanghai/2/2005（H1N1）亲缘关系密切。小鼠的致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠,导致小鼠轻微临床症状和肺脏组织病理学变化,但未在其他组织器官中分离到病毒,并且对小鼠无致死性,为低致病性SIV。该病毒的分离鉴定为广东地区SIV的流行特点和变异情况提供实验依据。

PA基因影响欧亚类禽型H1N1猪流感病毒致病性和传播能力的机制

不同宿主来源的流感病毒在猪体内经基因重配后可以产生新型病毒,解析新型流感病毒生物学表型变化机制对保护动物健康和预防人类流感大流行具有重要意义。近日,美国科学院院报《PNAS》杂志在线发表了题为“A Eurasian avian-like H1N1 swine influenza reassortant virus became pathogenic and highly transmissible due to mutations in its PA gene”的研究论文,揭示了猪流感病毒(SIV)致病性和传播能力增强的分子机制。

山东省H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及其致病性评价

本试验从山东省某集团养猪场采集疑似猪流感(swine influenza, SI)病猪的鼻拭子样品25份,将样品处理后接种10日龄SPF鸡胚,培养72 h后收集鸡胚尿囊液进行血凝试验和RT-PCR分型鉴定,并对分离到的病毒进行基因测序以及对仔猪致病性研究。结果显示,成功从鼻拭子样品中分离到一株猪流感病毒(swine influenza virus, SIV),经RT-PCR分型鉴定为H1N1亚型SIV,命名为A/swine/Shandong/12/2023(H1N1),简称SIV H1N1 SD12株。序列比对分析显示,SIV H1N1SD12株HA基因与GenBank中的A/swine/Shandong/LY059/2019(H1N1)的同源性最高为97.82%,HA蛋白的裂解位点为PSIQSRGL,具备低致病性SIV的分子特征,蛋白具有6个潜在糖基化位点;NA基因与A/swine/Beijing/0301/2018(H1N1)的同源性最高为97.80%,NA蛋白具有7个潜在糖基化位点,与NA抑制剂类药物敏感性相关的氨基酸位点未发生改变。致病性实验结果显示,感染组的仔猪出现猪流感典型症状(发热、流涕、喷嚏等),鼻拭子样品均检测到SIV排毒,剖检后仔猪肺脏出现实变,表明SIV H1N1 SD12株对仔猪具致病力。综上,本研究成功从山东省分离到1株H1N1亚型SIV,遗传进化分析显示SIV H1N1 SD12株属于欧亚类禽分支,对仔猪具有致病性,这为H1N1亚型SIV流行情况监测和猪流感防控提供参考。

H1N1亚型猪流感病毒HA1基因原核表达及鉴定

本研究利用RT-PCR技术扩增禽源H1N1亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的HA1基因片段,将其连接至p Cold-TF载体上,菌液鉴定为阳性的克隆经测序验证正确后,提取质粒转化至高表达的表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导并大量表达目的蛋白。表达产物经过纯化及SDS-PAGE电泳分析,表明重组蛋白以可溶性形式在上清中大量表达,大小约90 k Da,且在15℃、0.8 mmol/L IPTG条件下诱导24 h表达效果最好。通过Ni柱纯化后,经Western blot分析表明重组表达的蛋白能与禽源H1N1亚型SIV阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定与进化分析

为探究猪流感病毒(SIV)的流行情况,本实验室2020年11月从广州市某养殖场采集病猪鼻拭子30份,将鼻拭子接种9日龄SPF鸡胚,增殖后分离到1株具有凝血特性的病毒,经特异性PCR鉴定为流感病毒,通过进一步测序发现该病毒为H1N1亚型,命名为A/swine/Neimeng/03/2020(H1N1)。通过NCBI进行各基因片段的同源性比对,发现该病毒的基因与2000年左右的人H1N1亚型病毒同源性较高。通过构建系统遗传进化树发现,确认病毒株是由人流感病毒A/Dunedin/2/2000(H1N1)演化而来。通过HA基因推导发现该病毒HA1蛋白与2009年墨西哥流感的流行毒株以及经典的H1N1毒株具有较大的抗原性差异,该病毒呈现较低的致病性,与其HA裂解位点基序(PSIQSRGLF)表现一致,呈低致病性特征。

四川省遂宁市人感染H5N1禽流感动物疫源追踪调查

禽流感（Avian Influenza）,是由A型流感病毒引起的一种禽类传染病,H5N1为高致病性禽流感病毒。1997年5月,香港报告了全球首例人感染H5N1禽流感病毒死亡的病例,死者是一个3岁的男孩-（[1]）。2006年4月,遂宁市船山区唐家乡余建村发生1例人感染H5N1禽流感,患者是一个8岁的女孩,经治疗后康复。