进化免疫球蛋白结合分子LD5的原核表达、纯化及结合活性

目的对新型进化免疫球蛋白(Ig)结合分子LD5进行原核表达和纯化,并鉴定其结合活性。方法将LD5基因片段克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌后,IPTG诱导表达。以8mol/L尿素裂解菌体后,上清经Ni2+-NTA柱纯化,并对纯化蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析。以ELISA和Dot blot对LD5蛋白结合IgG、IgM活性进行鉴定。结果LD5分子在大肠杆菌中获得成功表达,表达的融合蛋白相对分子质量为59000。Western blot表明纯化的LD5蛋白能特异结合IgG。ELISA结果显示,LD5在结合IgM上较SpA具有明显的优势。结论LD5分子在大肠杆菌中已成功表达,纯化的LD5蛋白保留了天然Ig结合分子的结合活性。

人和羊IgG对噬菌体展示细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的体外进化筛选

目的使用人和羊不同物种IgG来诱导噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同的Fc段构像是否具有特异的结合优势,同时探索其优势结合序列的组合特点。方法通过PCR获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的A、B、D、E和链球菌(C和G群)蛋白G(SpG)的B2、B3各单结构域片段,构建由该6个片段随机组合的噬菌体展示文库。再分别使用人和羊IgG对文库进行体外亲和筛选,以期能够获得具有特异优势结合能力的组合分子,并在Phage ELISA的水平上进一步验证筛选结果。结果成功构建了符合进行体外进化筛选要求的噬菌体展示单结合结构域随机组合文库后,经过6轮人IgG诱导筛选,文库的展示片段大小统一为3个结构域组合分子,E-B-B3;经过6轮羊IgG诱导筛选,文库的展示片段大小也统一为4个结构域组合分子,D-A-B3-B3。Phage ELISA进一步验证最终组合序列的对人和羊IgG的结合能力。结论首次得到两种天然SpA、SpG分子中不存在的,且分别特异地与人和羊IgG具有强结合作用的新型组合分子E-B-B3、D-A-B3-B3,在人和羊IgG的纯化和检测具有很大的应用前景。

噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的构建

目的:构建由免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合的噬菌体展示文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选研究打下基础。方法:PCR扩增制备分别编码Protein A 的A、D结构域、Protein G的B2 结构域和Pro tein L的B3结构域的序列片段,片段两端引入XbaⅠ酶切位点,3′端引入分别编码0、1、2、3个氨基酸大小随机连接肽的序列,并克隆于pMD 18T载体构建重组质粒。以上述16种重组质粒为模板,PCR扩增分别制备各种单结构域片段及两端部分T载体序列,XbaⅠ酶切,各种酶切片段混合后连接,并克隆于噬菌体展示载体pCANTAB5S,构建噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库,挑取单克隆进行序列测定,评价文库的随机性。结果:噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库库容量为2×107,滴度为1.3×1011;文库中含77%以上的阳性克隆,其中由2个以上单结构域组成的阳性克隆占24%;序列分析显示组合文库包含上述4种单结构域序列,连接方式符合随机连接的特点,随机连接肽的编码核酸也呈随机分布。结论:成功构建了免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库,该文库库容、多样性和随机性完全可满足进行体外分子进化研究的要求。

噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库的构建

目的构建噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选及结构和功能的研究打下基础。方法应用overlapping PCR制备Protein A的Z结构域。用含随机核苷酸序列的引物,制备对Z结构域的第10、13、27、28、31和32位氨基酸进行随机突变的定点随机突变体库。并在突变体片段两端引入KpnⅠ位点,3′端引入3个氨基酸大小随机连接肽的序列。经KpnⅠ酶切后随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S。克隆产物转化大肠杆菌TG1,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示定点随机突变组合文库。结果该定点随机突变组合文库的转化子数目为6.4×106个,滴度为1.4×1015TU/L;文库中含0.72以上的阳性克隆,其中有2个单结构域的阳性克隆占0.15;15个样品的序列分析显示各突变位点和随机连接肽的氨基酸序列呈随机性分布。结论成功构建了噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,该库库容量在一级结构上具有良好的随机性和多样性,可满足体外分子进化研究的要求。

免疫球蛋白重链可变段和T细胞受体可变段的分子进化研究

为阐明免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)在抗体多样性产生机理上的异同,作者比较了Ig重链可变段(Ig V_H)和TCR可变段(TCR V)的密码子替代率和协同进化,并分析异同的原因。共搜集8种鼠和3种人的TCR α链可变段(V_α),11种鼠和1种人的TCRβ链可变段(V_β),以及2种鼠和4种人的T细胞γ链可变段;同时搜集11种鼠、3种人、3种南美鳄鱼和1种鲨鱼的Ig V_(H_(o))研究结果揭示:(1)对编码蛋白质的密码子来说,TCR V(包括V_α和V_β)的核苷酸替代率为Ig V_H的2.4倍,说明前者有更高的替代率。(2)以协同进化而言,TCR V和Ig V_H的基因重复率分别为1.7×10^(-6)和1.6×10^(-6)/基因年。两者几乎相同,均系低速保持者。TCR V的数目(V_α为100,V_β为30)远少于Ig V_H(数目为300),原因是前者受到主要组织相容性复合体的制约,即受到负选择,这与中性学说观点相一致。文章还讨论了体细胞突变和DNA重排对两类抗体多样性产生上的作用,并探讨了IgV_H和TCR V的假基因问题。

乌司他丁与内质网分子伴侣免疫球蛋白结合蛋白的分子对接和结合作用

目的通过测定乌司他丁与免疫球蛋白结合蛋白(Bip)在脑缺血再灌注模型大鼠血清、大脑皮层中的浓度,以及两者的体外结合实验、模拟分子对接模型,探讨两者之间的相互作用。方法将36只雄性SD大鼠随机分为两组。正常组(n=18)大鼠经静脉注射乌司他丁20万IU/kg作为对照。实验组(n=18)大鼠在建立大脑中动脉栓塞模型(MCAO)后随即静脉注射乌司他丁20万IU/kg。采用酶标仪法、ELISA法分别测定乌司他丁及Bip在大鼠脑缺血后0.5、3、24h中血清、大脑皮层中的浓度。通过乌司他丁与Bip的结合实验计算两者结合率,并利用软件模拟乌司他丁与Bip的分子对接模型。结果在患侧大脑皮层中,实验组乌司他丁浓度在3h升高,24h下降,而Bip浓度则在3h中下降,24h升高。乌司他丁与Bip的结合率为44%~62%,分子对接结果显示乌司他丁与Bip中的残基可形成范德华力及共轭作用,两者可形成不稳定复合物。结论在缺血大脑皮质中乌司他丁可与Bip形成不稳定复合物,其可能通过影响Bip的表达而在脑缺血再灌注中发挥着一定作用。

IgA亲和体随机组合噬菌体文库的构建和体外分子进化

目的构建IgA亲和体随机组合文库并进行体外分子进化,研究IgA亲和体分子结构与功能的关系。方法基因合成两个IgA亲和体片段。3′端引入3个随机连接肽序列随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S,构建噬菌体展示随机组合分子文库。以人IgA为靶分子对该文库进行4轮亲和筛选。制备阳性筛选克隆的单克隆噬菌体,用ELISA鉴定IgA结合活性。结果成功构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合分子文库,库容量为3.4×107,滴度为1.6×1012TU/L,阳性克隆占79%以上,序列分析IgA亲和体随机连接,随机连接肽序列呈随机分布。在人IgA分子诱导的分子进化过程中,展示多个IgA亲和体串联体的噬菌体比例明显增加,获得3种新型IgA亲和体组合分子结构形式:IgA亲和体二联体、三联体和四联体。ELISA结合实验表明IgA亲和体三联体和四联体的IgA结合能力远大于单体和二联体。结论通过构建IgA亲和体噬菌体展示随机组合文库和体外分子进化的方法,获得多种新型组合分子,其中IgA亲和体三联体和四联体的IgA结合能力明显增加,提示通过有效的分子进化成功地获得了高亲和力的IgA结合分子。

细菌免疫球蛋白结合分子特性及应用的研究进展

免疫球蛋白结合蛋白[Immunoglobulin(Ig)-binding protein,IBP]是多种病原体产生的以非抗原形式与免疫球蛋白结合的蛋白,在病原体致病中发挥重要作用。这些蛋白各自具有独特的结构特征及结合特性,赋予其抗体纯化、抗体检测和抗体吸附的应用潜能,已广泛应用于科研、病原体感染抗体特异诊断、抗体药物纯化及临床免疫吸附治疗。应用重组技术所构建的融合IBP较好地保留了母体分子的结合特性,并很好地弥补了各自对不同IgG结合的不足,显著提升了在抗体纯化和免疫沉淀方面的应用优势。应用分子进化技术所获得的由不同IBP单结合结构域组合而成的新型进化免疫球蛋白结合分子(novel evolved immunoglobulin-binding molecule,NEIBM),具有母体IBP所没有的新的Ig结合模式,其中对Ig Fabκ轻链和VH3重链的双位点协同结合大大提高了与IgM的结合能力,并显示出在病原体特异性抗体检测中的应用优势。本文对主要的天然IBP、重组IBP和NEIBM的结构特征、结合特性及其应用作一综述。

草鱼凝集素分子的基因克隆与进化分析

草鱼是我国重要的养殖淡水鱼,其产量以及产值居于鱼类养殖业的前列。凝集素是一类具有糖结合专一性,并与之非共价可逆结合的非酶、非免疫来源的蛋白质,其中把活性依赖于Ca2＋者称为C型凝集素。C型凝集素都具有一个或多个糖结构识别域（Carbohydrate-recognition domain,CRD）。鱼类中所存在的天然凝集素分子在其非特异性免疫中占据重要地位,是鱼类抵御异己物质入侵的一道防线。材料与方法材料。在超市购买健康的草鱼,体长大约为30cm,体重为1.47kg。方法。

新型冠状病毒受体结合域-Fc融合蛋白表达及小鼠免疫原性

目的表达制备新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域(receptor binding domain, RBD)-Fc融合蛋白, 并评价其在小鼠模型中的免疫原性。方法将新型冠状病毒RBD与小鼠免疫球蛋白Fc段融合基因在中国仓鼠卵巢细胞中表达并制备融合蛋白。将不同剂量的RBD-Fc融合蛋白分别单独或辅以氢氧化铝佐剂免疫小鼠, 通过ELISA、假病毒中和试验、酶联免疫斑点试验检测诱导产生的体液和细胞免疫应答。结果 10 μg RBD-Fc融合蛋白辅以氢氧化铝佐剂能有效诱导小鼠产生良好的RBD特异性IgG抗体应答, 该抗体可阻断病毒RBD与细胞表面病毒受体的结合, 进一步研究表明该重组蛋白还诱导产生了针对原始毒株、Beta变异株和Delta变异株假病毒的中和抗体, 中和抗体滴度分别为1 566、336和270。结论制备的RBD-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性, 可为开发COVID-19重组蛋白疫苗提供参考。

缺血性脑卒中患者血清TIM-3、GATA-3与颅内动脉斑块稳定性的关系

目的探讨缺血性脑卒中患者血清T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(TIM-3)、GATA结合蛋白-3(GATA-3)与颅内动脉斑块稳定性的关系。方法选取2021年4月—2023年4月海南医学院第一附属医院收治的124例缺血性脑卒中患者作为研究对象,根据高分辨率磁共振(HRMRI)颅内动脉管壁成像检查结果分为无斑块组19例、稳定斑块组28例、不稳定斑块组77例。采用酶联免疫吸附试验检测血清TIM-3、GATA-3水平;采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清TIM-3、GATA-3对缺血性脑卒中患者颅内的动脉斑块稳定性的预测价值;采用多因素逐步Logistic回归分析探究影响缺血性脑卒中患者颅内动脉斑块稳定性的因素。结果无斑块组、稳定斑块组、不稳定斑块组患者的高血压患病率、颅内动脉狭窄程度构成比、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、同型半胱氨酸(Hcy)、C反应蛋白(CRP)水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。无斑块组、稳定斑块组、不稳定斑块组患者血清TIM-3、GATA-3水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);稳定斑块组、不稳定斑块组血清TIM-3水平高于无斑块组(P<0.05),不稳定斑块组血清TIM-3水平高于稳定斑块组(P<0.05);稳定斑块组、不稳定斑块组血清GATA-3水平低于无斑块组(P<0.05),不稳定斑块组血清GATA-3水平低于稳定斑块组(P<0.05)。ROC曲线结果显示,TIM-3联合GATA-3预测缺血性脑卒中患者颅内动脉斑块稳定性的曲线下面积(AUC)最大,为0.903(95%CI:0.846,0.957),特异性为85.7%(95%CI:0.832,0.943),敏感性为84.0%(95%CI:0.795,0.892)。多因素逐步Logistic回归分析显示,颅内动脉狭窄程度高[O^R=2.016(95%CI:1.419,2.863)]、高水平Hcy[O^R=2.323(95%CI:1.567,3.445)]、TIM-3≥393.78 ng/L[O^R=3.022(95%CI:1.903,4.800)]、GATA-3≤38.49ng/L[O^R=2.497(95%CI:1.645,3.790)]是缺血性脑卒中患者颅内动脉斑块不稳定的独立危险因素(P<0.05)。结论高水平TIM-3、低水平GATA-3与缺血性脑卒中患者颅内动脉斑块稳定性下降有关,且两项指标可作为预测患者颅内动脉斑块稳定性的血清标志物。

不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体文库的体外进化研究

目的判断不同亚类小鼠IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点,采用不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体展示文库进行亲和筛选。方法不同亚类小鼠IgG对噬菌体文库进行亲和筛选,获得具有结合优势的单结构域排列组合,噬菌体ELISA法来比较其与不同亚类小鼠IgG的结合特性,优势组合分子经原核表达蛋白,HRP标记后,ELISA法进一步来比较其与小鼠不同亚类IgG的结合特性。结果小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3分别经过5、4、5和5轮亲和筛选后,其文库的展示片段大小均为2个domain,表明进化完全。测序分析显示:小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3筛选得到的具有结合优势组合分子分别是D-D、D-D、A-C和D-C。噬菌体ELISA验证结合优势组合分子对小鼠不同亚类IgG的结合能力;蛋白经HRP标记后的ELISA结果和筛选不完全一致,但其结合强弱具有一致性,均为:IgG3>IgG2a>IgG2b>IgG1。结论得到3种不存在于天然SpA、SpG分子中,分别与不同亚类小鼠IgG具有较强结合作用的新型组合分子D-D、A-C和D-C,为进一步研究IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点提供了新的参考分子。

Siglec家族成员在免疫调控与免疫病理中作用的研究进展

唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-binding Ig-like lectins,Siglecs)是一类免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,Ig SF)成员,可通过识别含有唾液酸的糖链结构,介导细胞与细胞或病原体间的相互作用,在固有免疫和适应性免疫中发挥重要的调控作用。近年来研究表明,Siglec家族成员参与免疫细胞活化、增殖以及凋亡的调控;同时,Siglec家族成员也参与免疫耐受的调控,并在自身免疫病、炎症反应以及肿瘤发生中发挥重要的免疫调控作用;因此,越来越多的靶向Siglecs抗体或糖基化配体的治疗药物被相继研发并用于淋巴瘤、白血病和自身免疫疾病等多种Siglecs相关疾病的治疗。现就Siglecs参与免疫调控及其在抗自身免疫病和抗肿瘤发生中的研究进展作一综述。

蛋白质结构七层次

问:蛋白质结构可划分为几个等级? 答:可分为一、二、三和四,共四个结构等级。像这样的回答是无可非议的。

SARS-CoV-2辅助蛋白ORF8的功能及研究进展

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与2002年开始流行的冠状病毒(SARS-CoV)基因组相似,编码多种病毒蛋白。其中辅助蛋白ORF8与SARS-CoV ORF8有较低的序列同源性,且有快速进化和突变的特征,具有抑制Ⅰ型干扰素、下调主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)表达等功能。该文就SARS-CoV-2辅助蛋白ORF8的结构、功能及对COVID-19的诊断治疗前景进行综述。

母血及羊水中TIM-3、GATA-3水平对胎膜早破合并宫内感染的诊断价值

目的分析母血及羊水中T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(TIM-3)、GATA结合蛋白3(GATA-3)水平对胎膜早破(PROM)合并宫内感染的诊断价值。方法选择PROM患者89例作为研究对象,发生宫内感染者42例作为感染组,未发生宫内感染者47例作为未感染组,并选择同期正常足月孕妇45例作为对照组。根据宫内感染严重程度将PROM合并宫内感染患者分成轻度组16例、中度组17例、重度组9例。检测血、羊水中TIM-3、GATA-3mRNA及蛋白水平,比较对照组、未感染组、感染组和不同感染程度孕妇血、羊水中TIM-3、GATA-3 mRNA及蛋白水平,受试者工作特征曲线分析血清及羊水中TIM-3、GATA-3蛋白单独及联合诊断PROM孕妇发生宫内感染的效能。结果对照组、未感染组、感染组血及羊水中TIM-3 mRNA、蛋白水平依次升高(P<0.05),GATA-3 m RNA、蛋白水平依次降低(P<0.05);轻度组、中度组、重度组血及羊水中TIM-3 mRNA、蛋白水平依次升高(P<0.05),GATA-3mRNA、蛋白水平依次降低(P<0.05);血清TIM-3、GATA-3蛋白单独及联合,羊水TIM-3、GATA-3蛋白单独及联合诊断PROM孕妇发生宫内感染的曲线下面积分别为0.854、0.813、0.937,0.834、0.850、0.922。结论PROM合并宫内感染患者母血及羊水中TIM-3呈高表达,GATA-3呈低表达,两者均对PROM孕妇发生宫内感染有一定的诊断价值,联合诊断效能更高。

人IgG四亚类对噬菌体展示Ig结合蛋白单结构域随机组合文库的体外进化筛选

金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SpA)和链球菌蛋白G(Streptococcal protein G,SpG)是细菌产生的特异结合宿主抗体的细菌免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin(Ig)-binding proteins,IBPs)的代表分子。SpA和SpG均包含由多个序列高度同源的结合结构域重复组成的抗体结合区,各单结构域都具有完全的结合IgG的功能。为研究这些单结构域随机组合能否产生具有新结合特性的组合分子,将SpA的A、B、C、D、E以及SpG的B2、B3共7个单结合结构域随机组合构建成噬菌体展示文库后,应用人IgG1、2、3、4为诱饵分子对该文库进行4轮筛选,获得了SpA天然分子中不存在的单结构域排列组合分子D-C。在筛选过程中,阴性对照噬菌体的逐渐减少、展示两个结构域以上的噬菌体比例不断增多,尤其是D-C组合的选择性富集和其随机连接肽的严格筛选都显示了筛选的有效性和D-C组合的重要性。噬菌体ELISA进一步证实D-C与人IgG四亚类的结合能力远强于天然SpA分子。该研究应用分子进化技术首次获得了一种与人IgG四亚类具有结合优势的新型组合分子D-C,不仅可为IgG纯化、制备、检测等方面的应用提供新的候选分子,还为细菌IBP结构功能的进一步研究提供新的手段。

腹型过敏性紫癜患儿血清I-FABP、G-17、Tim-3的表达及其临床意义

过敏性紫癜(HSP)是儿科常见病,主要是由免疫性复合物引起的小血管炎,表现为皮肤紫癜、关节、肠道及肾脏小血管的炎症和出血^([1])。HSP根据临床症状可分为腹型、单纯皮肤型、关节型、混合型及肾型等,其中以单纯皮肤紫癜为主^([2])。

利妥昔单抗诱导性肺损伤

利妥昔单抗（Rituxmab，RTX）是一种人／鼠嵌合型免疫球蛋白G1-κ型单克隆抗体，与表达在B细胞和部分T细胞表面CD20分子特异性结合，通过激活补体和NK细胞，诱导细胞凋亡。

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38(SjP38)抗原分子,并以其纯化产物为抗原,制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。方法将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),在1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过镍柱一步法纯化,以纯化的重组SjP38为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,蛋白质印迹法(Westernblotting)分析其特异性。结果筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株,均为IgG1;Westernblotting分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。结论制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。