新型青枯雷尔氏菌来源双核含铜酪氨酸氧化酶的异源表达及生化性质鉴定

左旋多巴(Levodopa,L-DOPA)能有效治疗帕金森病(Parkinson’s Disease,PD),寻找能够专一性催化酪氨酸合成L-DOPA的新型酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)具有重要意义。研究将来源于青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的酪氨酸氧化酶(RsTYR)基因构建到重组质粒中化转至大肠杆菌中进行异源表达并对表达条件进行了优化。结果表明,在BL21(DE3)大肠杆菌中,当诱导温度达到25℃,诱导剂异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度为0.5 mmol/L,诱导时间设置为12 h时,RsTYR蛋白能够获得较高表达量(0.4 mg/mL)。随后,通过Ni树脂亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法对RsTYR蛋白进行纯化,获得高纯度的重组蛋白。随后利用精制的RsTYR蛋白,对其进行了产物鉴定和酶学性质表征研究,结果表明RsTYR能特异性的将L-酪氨酸合成L-DOPA。该酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为6.5。在pH为7.0时RsTYR催化性质最稳定,最适缓冲液为PBS缓冲液,在pH 6.0~7.5间,酶分子仍具有50%以上的残余活性,且K^(+)能够提高RsTYR的活性。同时测定了RsTYR的酶动力学参数,其K_(m)和k_(cat)值分别为0.63μmol/L和9.61 s^(-1)。同源序列分析结果表明RsTYR属于Tyrosinase Superfamily,并且通过同源建模及序列对比分析预测了该酶的保守催化活性位点His81、His93、His102、His227、His231、His253。本研究为生物合成L-DOPA提供了一种新酶选择,为L-DOPA的生物催化合成提供了一定的理论基础。