新型降钙素的制备及活性测定

新型降钙素 (一种人降钙素类似物 )基因工程菌nCT/ pGEX 2T/E .coliBL2 1经 2 0L规模发酵 ,离心收集细胞 ,反复冻融裂解细胞 ,裂解液经G Sepharose 4B亲和层析纯化得到融合蛋白。融合蛋白进行磺酸化和溴化氰裂解后 ,用S Sepharose纯化得到新型降钙素前体 ,其纯度为 97 6 %。选用羧肽酶Y(CPY)将其前体转化为C 末端酰胺化的新型降钙素 ,转化率为 34 %。转化液经HPLC分离纯化得到新型降钙素。大鼠体内降血钙试验表明新型降钙素具有显著降血钙活性。

新型降钙素的基因合成与克隆表达

借助计算机辅助设计了一种新的人降钙素类似物 (新型降钙素 )。根据密码子偏爱性原理及基因工程操作原则设计了它的基因 ,运用化学法和酶法相结合的技术合成了该基因 ,并克隆到质粒 pUC19中 ,DNA测序验证正确。该基因被克隆到融合型表达载体pGEX 2T中 ,重组融合型表达载体nCT/ pGEX 2T转化E coliBL2 1,培养表达 ,SDS PAGE分析可见Mr 约 310 0 0的融合蛋白带 ,融合蛋白占细胞内总蛋白的 34%。WesternBlotting分析证明该新型降钙素获得表达。

新型降钙素基因工程菌高表达发酵条件的研究

对新型降钙素基因工程菌 n CT/p GEX-2 T/E.coli BL2 1高表达发酵条件进行了优化研究。研究表明重组工程菌遗传性状稳定 ,采用 LB培养基、1 %接种量 ,当菌体浓度到达 A6 0 0 nm 0 .6时 ,添加诱导剂 IPTG至终浓度为 0 .l mmol/L,37℃培养 4 h,可使含新型降钙素的融合蛋白高效表达 ,融合蛋白占菌体总蛋白的 35%。2 0 L发酵罐中采用上述条件发酵培养 ,融合蛋白亦可高效表达 ( 32 % ) ,其菌体密度是摇瓶培养发酵的两倍。Western-blotting试验表明融合蛋白中含有新型降钙素 。

新型降钙素的分子设计

以人和鲑鱼降钙素为先导物 ,根据多肽类药物设计原理 ,借助多肽蛋白质计算机分析软件辅助设计了一种新的人降钙素类似物 ,简称新型降钙素 .计算机分析结果表明 :该新型降钙素等电点提高 (pI 8.7) ,C 末端亲水性增加 ,抗原表位分析图谱与人降钙素的相同 .利用基因工程法制备新型降钙素 。