用不同鸡新城疫病毒株 制备油乳剂苗的研究

应用４种鸡新城疫病毒 Ｌａ—Ｓｏｔａ， Ｕｌｓｔｅｒ， Ｂ１和 ＰＭＶ— Ｉ分别作为抗原，制备ＮＤ油苗。每组苗颈部皮下接种非免疫来航鸡，每隔１～２周采血检测ＨＩ抗体一次，直至免疫后第８周。用同源抗原检测ＮＤ苗免疫的ＨＩ抗体滴度普遍高于非同源抗原检测的ＨＩ抗体滴度（Ｌａ－Ｓｏｔａ油苗除外），不同 ＮＤ毒株油苗中， Ｕｌｓｔｅｒ油苗和 Ｂ１油苗的 ＨＩ抗体水平最高，其次是 Ｌａ－Ｓｏｔａ油苗， ＰＭＶ— Ｉ油苗 ＨＩ抗体水平最低。免疫接种８周后攻毒，四种ＮＤ油苗的免疫鸡均１００％健活，而对照鸡 １００％死亡。

不同新城疫病毒株结构蛋白的分析

2株新城疫病毒ND98、ND99分别分离自发病鸡群与雏鸵鸟,ND98属于中发型毒株,ND99属于缓发型毒株。将2株分离株ND98、ND99与参考毒株F48E8、Lasota进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质转移印迹(Western-Blotting)。SDS-PAGE结果显示,ND98、ND99与F48E8、Lasota具有相似的结构蛋白:HN蛋白、F蛋白、NP蛋白与P蛋白、M蛋白;Western-Blotting试验显示,ND98与F48E8、ND99与Lasota具有相似的免疫原,ND98、ND99免疫原性存在一定的差异。

生物矿化对新城疫病毒LaSota株生物学特性及免疫原性的影响

旨在研究生物矿化对新城疫病毒(NDV)LaSota株生物学特性及免疫原性的影响,为耐热活疫苗研发提供新思路。通过测定不同矿化条件下病毒粒径、血凝效价和斑点印记,确定NDV的最佳生物矿化条件;将矿化后病毒接种BHK-21细胞,检测矿化对病毒增殖的影响,同时比较热处理后的矿化病毒在BHK-21细胞中的滴度变化情况;利用抗体中和试验检测矿化病毒的免疫原性;最后通过饮水免疫的方式评估矿化病毒在SPF雏鸡上的免疫效果。结果显示:生物矿化条件经优化后,LaSota株在4 mmol·L^(-1)Na_(2)HPO_(4)和3 mmol·L^(-1)CaCl_(2)条件下矿化效果最好,此时矿化病毒粒径最大,血凝效价最低,矿化率高达98.25%。矿化的LaSota株在BHK-21细胞上增殖起始时间迟于未矿化病毒,但两者的最终增殖滴度没有显著差异。经NDV抗体中和后,矿化病毒滴度的下降值为103.0 TCID_(50)·mL^(-1),显著低于未矿化组。在56℃水浴中孵育15 min后,矿化的LaSota株病毒滴度仅下降103.5 TCID_(50)·mL^(-1),与TS09-C耐热株的耐热特性相当。矿化的LaSota株免疫SPF雏鸡14 d后,抗体水平均高于未矿化LaSota株免疫鸡群。免疫后42和78 d进行攻毒试验,矿化LaSota株免疫鸡群的存活率分别为100%和60%。综上所述,本研究优化了NDV LaSota株的最佳矿化条件,矿化会延缓病毒的增殖速度,但不影响病毒的增殖滴度。经矿化后,能降低病毒与抗体的中和反应并提升其热稳定性,并可通过饮水免疫的方式对SPF雏鸡提供较好的保护效果。本研究证实通过生物矿化开发新城疫耐热活疫苗是一条切实可行的思路,也为开发其他病毒耐热活疫苗提供参考和借鉴。

免疫鸡血清新城疫病毒抗体水平与攻毒保护效果的相关性研究

为了明确不同血清新城疫病毒(NDV)抗体水平对鸡的保护效果,本研究采用重组NDV灭活疫苗(A-Ⅶ株)对鸡进行免疫,通过交叉血凝抑制(HI)试验比较A-Ⅶ株与La Sota株间的血清学差异,并采用NDV标准强毒株F_(48)E_(8)和基因Ⅶ型强毒株JSC0804对不同抗体水平免疫鸡进行了攻毒保护试验。结果显示:抗A-Ⅶ株血清用A-Ⅶ株抗原测得的平均HI抗体效价显著高于La Sota株抗原(P<0.01),约高1.5log2,而抗La Sota株血清用La Sota株抗原测得的平均HI抗体效价稍高于A-Ⅶ株抗原,但无显著差异(P>0.05),表明2种疫苗株存在一定的血清学差异。在试验条件下,所有免疫鸡经点眼滴鼻攻毒后均未表现明显临床症状,但存在不同程度的排毒现象,排毒率总体上随抗体效价升高呈逐渐下降趋势。A-Ⅶ株疫苗免疫鸡血清HI抗体效价分别达≥13log_(2)和≥14log_(2)时可完全阻止F_(48)E_8株和JSC0804株排毒。免疫鸡排毒一般仅限于攻毒后5 d内。本研究阐明了免疫鸡的抗体水平和免疫保护效果的相关性,为新城疫免疫控制提供了依据。

新城疫病毒F_(48)E_8株 HN基因在杆状病毒系统中表达

目的 采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48 E8株HN基因表达。方法NDV F48 E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭载体Bacmid中,经筛选获得重组Bacmid HN转染到Sf-9昆虫细胞,并进行检测。结果 表达产物经SDS-PAGE、Westem blot检测获得蛋白特异带,相对分子质量约63000。结论NDVF48E8株HN基因能通过新型杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中进行表达,表达量约为细胞总蛋白的10％。

鸡新城疫病毒F48E9株血凝素神经氨酸酶基因免疫诱导免疫保护的初步研究

将我国新城疫病毒标准强毒F4 8E9株的血凝素 神经氨酸酶基因克隆于真核表达载体 pcDNA3 中 ,进行鉴定后筛选阳性质粒。将此阳性质粒进行大量法提取并纯化后作为基因疫苗以每只鸡 10 0 μg的剂量肌肉接种 4 5日龄SPF鸡 ,并以 pcDNA3 空质粒作为对照。结果表明 ,新城疫基因疫苗能够诱导机体产生新城疫病毒特异的血清IgG抗体反应 ,但产生抗体所需的时间较长 ,抗体滴度的增加较为缓慢。人工接种新城疫强毒后 ,基因疫苗免疫组 4 / 6的鸡得到保护 ,而且保护鸡具有明显的抗体反应 ,2只鸡未得到保护 ,但其死亡时间明显迟于对照组鸡 ,死亡鸡具有典型的新城疫病毒感染鸡的病理形态学变化。

新城疫病毒Mukteswar株F基因重组pGAPZα-F的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒Mukteswar株F基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶KpnⅠ和XbaⅠ对目的基因片段及质粒pGAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化E.coliDH5α。以PCR方法确定Mukteswar F1和Mukteswar F2的阳性重组子均为4个。对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1 198 bp、269 bp,与新城疫病毒Mukteswar株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致。结果表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2,研究Mukteswar株与基因Ⅶ型毒株之间F蛋白的抗原性差异程度打下基础。

鹅源新城疫病毒云南流行株动物回归试验

用分离的鹅源新城疫病毒KM2007株尿囊液分别接种25日龄非免疫雏鹅和25日龄非免疫雏鸡各20只,对照组每只鸡肌肉注射生理盐水。结果试验组鹅和鸡分别出现典型的鹅新城疫病和鸡新城疫的临床症状和病理变化,对照组全部健活。从发病及死亡鹅和鸡的脑/脾中分离到病毒。试验结果表明,分离病毒KM2007株与鹅自然感染发病的病原一致。

鹅源新城疫病毒云南流行株免疫交叉保护试验

用分离的鹅新城疫病毒KM2007株尿囊液制成油乳剂灭活苗,和NDV油乳剂灭活苗分别接种10日龄未免疫雏鸡和未免疫雏鹅,并设非免疫对照组。免疫后21 d,试验组和对照组每只鸡和鹅分别注射0.1 mL鹅新城疫病毒KM2007株尿囊液10-1稀释液,结果对照组鹅和鸡分别出现典型的鹅新城疫和鸡新城疫的症状和病理变化,而试验组鹅和鸡全部健活。结果表明,鹅新城疫病毒KM2007株油乳剂灭活苗及NDV油乳剂灭活苗均可保护鹅和鸡免受鹅新城疫病毒野毒的攻击。

新城疫热稳定性天然弱毒株B95免疫效果的研究

分别用NDV疫苗株和不同稀释度的B95毒株 ,经不同免疫途径进行雏鸡的免疫 ,当雏鸡NDV母源抗体下降到较低水平时 ,B95病毒液 5 0倍稀释组在免疫后 5d即可见抗体滴度上升 ,到达高峰时抗体效价比免疫前上升 4.6个滴度 ,在攻毒试验中 ,除B95 10 0 0 0倍稀释组外 ,其余B95各组在免疫后 15d、30d攻毒保护率均为 5 / 5 ,即全部保护。当在雏鸡母源抗体较高时免疫 ,B95病毒液 5 0倍稀释组抗体达高峰时其效价比对照组高 2 .5个滴度 ,结果表明 ,该组与Clone30疫苗组免疫效果相当 。

鸽新城疫病毒QL株一些理化及培养特性

本试验对鸽新城疫病毒 QL株在鸡胚中的培养特性、血凝素热稳定性及对甲醛溶液、胰蛋白酶等理化因素的影响进行了测定 ,结果为 QL株接种鸡胚后 96h生长达高峰 ,QL株可耐受5 6℃ 40 min,0 .1 %甲醛溶液能完全灭活 QL株尿囊液 ,且仍保持较好的抗原性 ,0 .5 %胰蛋白酶37℃消化 30 min后 ,血凝性升高。试验结果为合理利用

拯救新城疫病毒LaSota株辅助质粒的构建

本实验室保存的LaSota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的LaSota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒并酶切鉴定,鉴定正确的样品进行序列测定,并比对测序结果。结果证明测序结果与GeneBank上公布的LaSota株新城疫病毒序列完全一致,没有任何氨基酸和核苷酸的变化,将NP、P、L分别连接至pVAX载体,其中L1～L4为顺次连接。鉴定结果表明NP、P和L基因已正确克隆至pVAX表达载体,证明3个辅助质粒构建成功,分别命名为pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。

新城疫病毒D90毒株抑制人胃癌BGC-823细胞的体外研究

为了探究NDV-D90对BGC-823细胞的抑制作用,通过细胞毒性、肿瘤细胞侵袭和流式细胞术实验,来确定新城疫病毒D90毒株(Newcastle disease virus,NDV-D90)对胃癌细胞株BGC-823(低分化)的抑制作用。结果显示:NDV-D90能抑制BGC-823细胞的增殖和侵袭,病毒在BGC-823细胞中有很强的复制能力,并且NDV-D90对BGC-823细胞主要造成坏死并伴随着少量的凋亡。

鸡新城疫La Sota株、鸡传染性支气管炎W_(93)株二联活疫苗研究 Ⅱ.接毒剂量选择试验

将鸡新城疫LaSota毒种和嗜肾型鸡传染性支气管炎W93毒种分别用生理盐水做适当稀释后,将两种病毒液等量混合,接种于同一SPF鸡胚尿囊腔内。结果表明,IBV、NDV在同一鸡胚内增殖时无互相干扰现象;收获的鸡胚液(LaSota+W93)中NDV、IBV的效价分别达到相应单苗水平。

新城疫弱毒耐热B株蚀斑克隆纯化与免疫原性研究

通过鸡胚终点稀释法与细胞蚀斑法纯化获得新城疫病毒克隆株(NDVB-Clone4株),结果显示,NDVB-Clone4株的免疫原性最好。原毒和鸡胚终点稀释法纯化毒滴鼻/点眼免疫1000EID50剂量组鸡10/10攻毒保护,而蚀斑纯化毒滴鼻/点眼免疫300EID50剂量组鸡10/10攻毒保护。

鸡新城疫低毒力耐热保护剂活疫苗—锐必新

鸡新城疫低毒力耐热保护剂活疫苗——锐必新是瑞普（保定）生物药业有限公司以围外引进配方为基础。以鸡新城疫病毒LaSota株为种毒研制出的耐热保护剂活疫苗系列产品之一。经检验，锐必新各项指标已达到国外同类产品质量标准，达到国内领先水平。2005年9月22日，该产品已获农业部核发的《新兽药注册证书》【证号：（2005）新兽药证字30号】。

新城疫病毒西藏分离株的生物学特性鉴定及遗传进化分析

从西藏病死藏鸡中分离到具有血凝活性的病毒、经血凝抑制试验、电镜观察、PCR扩增和测序鉴定为新城疫病病毒(NDV),通过动物致病性试验证明该病毒对鸡具有致病性;分离毒株毒力测定结果显示,MDT为120h,EID50为10-8.44、IVPI为0.5、ICPI为0.6,均符合NDV弱毒株特征。血凝解脱及血凝素热稳定性试验显示:各分离株的血凝解脱时间短,血凝素热稳定性较差,符合NDV弱毒株的特征。F基因的序列测定遗传进化分析表明,西藏分离毒株之间的核苷酸序列具有99%的同源性,与疫苗株LaSota的同源性为90%;与国内标准强毒株F48E8同源性为81%。推导其氨基酸序列分析表明,各分离株的F蛋白的裂解位点氨基酸112 G-K-Q-G-R-L117,具有NDV弱毒株特征,与毒力测定结果相符。本研究首次报道了NDV西藏分离毒株遗传进化情况和生物学特性情况,为进一步研究高海拔、缺氧环境下NDV生物学特性变化研究奠定了基础。

MPAIV、NDV Lasota株分别与较低致病性禽源E.coli的联合感染试验

以 2× 1 0 5EID50 的低致病性禽流感病毒 ( mildly pathogenic avian influenza virus,MPAIV)、2× 1 0 6 EID50 新城疫病毒 L asota株( Newcastle disease virus Lasota strain,NDVL asota)气管内注射 1 0日龄 SPF鸡 ,2 4h后 ,同剂量、同法重复感染一次 ;48h后 ,分别气管内注射较低致病性禽病原性大肠杆菌 1 2 0( O1 8)和 1 73( O2 6 )株 ,2× 1 0 7CFU/羽 ,2 4h后同剂量、同法重复攻毒一次 ,连续观察 1 0d。结果 :MPAIV单独感染组死亡率为 53% ;NDV Lasota株单独攻毒组未见死亡 ;大肠杆菌 1 2 0株单独攻毒组死亡率为 40 % ,1 73株单独攻毒组死亡率为 7% ;MPAIV与大肠杆菌1 2 0株联合攻毒组的死亡率为 87% ,NDV L a-sota株与 1 2 0株联合攻毒组的死亡率为 40 % ;MPAIV与大肠杆菌 1 73株联合攻毒组的死亡率为 80 % ,NDV Lasota株与 1 73株联合攻毒组的死亡率为 2 0 %。

1株抗肝肿瘤新城疫病毒溶瘤株F基因的克隆和测序

目的对我们发现的1株高效抗肝肿瘤新城疫病毒溶瘤株的F基因进行扩增、序列测定和分析。方法RT-PCR扩增F基因片段,序列测定后与国际标准株弱毒株LaSota、B1及强毒株HER33、ITA/45、TEX/48、JS206WD、YG03的F基因比较研究,并对这株病毒F蛋白分子结构的疏水性、抗原表位及进化树分析。结果扩增出的F基因片段核苷酸长度为1656bp,单一的开放读码框编码552个氨基酸,其核苷酸序列与以上7种NDV的F基因同源性分别为:87.1%、87.5%、91.4%、91.7%、87.5%、90.7%、92.4%,氨基酸序列同源性为:90.2%、89.7%、94.9%、93.8%、90.8%、94.4%、95.5%。F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,与所有强毒株在这一区域的序列(112R/K-R-Q-K/R-R-F117)相符,疏水性与抗原表位均与强毒株相似,进化树分析属于基因VI型。结论推测新发现的1株高效抗肝肿瘤新城疫病毒为NDV基因Ⅵ型强毒株。

rL-RVG通过拮抗α7烟碱型乙酰胆碱受体影响胃癌细胞凋亡及增殖

目的:探讨表达狂犬病毒糖蛋白(RVG)的重组La Sota株新城疫病毒(recombinant La Sota strain NDV expressing the rabies virus glycoprotein,rL-RVG)是否通过α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)影响胃癌细胞HGC的增殖与凋亡。方法:将rL-RVG、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)和PBS分别感染胃癌HGC细胞24 h后,采用蛋白质印迹法检测RVG、NDV、pro-caspase 3蛋白和α7-nAChR在HGC细胞中的表达,免疫荧光检测α7-nAChR在HGC细胞中的表达,MTT检测HGC细胞的增殖情况。将HGC细胞随机分为rL-RVG组、rL-RVG+α7-nAChR抑制剂组、rL-RVG+α7-nAChR激动剂组,NDV组、NDV+α7-nAChR抑制剂组、NDV+α7-nAChR激动剂组,PBS组、PBS+α7-nAChR抑制剂组、PBS+α7-nAChR激动剂组;倒置显微镜下观察各组细胞形态,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白pro-caspase 3、bax、bcl-2表达水平。结果:蛋白质印迹结果显示,病毒感染HGC细胞24 h后,NDV、pro-caspase 3蛋白和α7-nAChR在rL-RVG组、NDV组的表达均显著高于PBS组(P均<0.01),RVG蛋白在rL-RVG组表达显著高于NDV组和PBS组(P均<0.01);免疫荧光显示α7-nAChR在rLRVG组中明显高于NDV组和PBS组。MTT结果显示两种病毒浓度大于10-5mmol/L对细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.05)。倒置显微镜下可见NDV+α7-nAChR抑制剂组、PBS+α7-nAChR抑制剂组HGC细胞分别较NDV组、PBS组皱缩、凋亡更明显,但rL-RVG组与其α7-nAChR抑制剂组相比细胞皱缩、凋亡差异不明显;rL-RVG+α7-nAChR激动剂组、NDV+α7-nAChR激动剂组、PBS+α7-nAChR激动剂组HGC细胞皱缩、凋亡分别较rL-RVG组、NDV组、PBS组明显减弱。蛋白质印迹显示bcl-2、bax和pro-caspase 3蛋白在rL-RVG+α7-nAChR抑制剂组的相对表达量与rL-RVG组无显著性差异(P均>0.05),但在NDV+α7-nAChR抑制剂组、PBS+α7-nAChR抑制剂组的相对表达量分别较NDV组、PBS组显著上调(P均<0.01);rL-RVG+α7-nAChR激动剂组、NDV+α7-nAChR激动剂组、PBS+α7-nAChR激动剂组的bax、pro-caspase 3蛋白相对表达量分别较rL-RVG组、NDV组和PBS组明显下调(P均<0.01),bcl-2蛋白相对表达量则明显上调(P均<0.01)。结论:rL-RVG感染HGC后稳定表达,可能通过拮抗α7-nAChR途径促进胃癌细胞的凋亡和抑制其增殖。