基于NP基因的新城疫病毒Class I实时荧光定量RT-PCR方法的建立及验证

新城疫病毒是影响养禽业健康发展的主要病原之一。新城疫病毒只有1个血清型,但根据亲源关系可以划分为Class I和ClassⅡ两大类。为快速定量检测Class I新城疫病毒,根据其NP基因的保守序列,设计合成1对引物和Taq Man探针,以Class I新城疫病毒JS-18-05株NP基因阳性重组质粒为标准品模板,建立荧光定量PCR标准曲线,首次建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测新城疫病毒Class I核酸载量的Taq Man荧光定量RT-PCR方法。该方法在102~108拷贝范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中1μl 10拷贝的病毒核酸,与传统的病毒分离方法具有相近的敏感性,且这两种方法对33株Class I、ClassⅡ新城疫病毒分离株尿囊液样品检测结果符合率为100%。

新城疫病毒ClassⅠ强毒株HN单克隆抗体的研制及免疫学反应

目的:制备抗新城疫病毒(NDV)ClassⅠ强毒分离株9a5b的单克隆抗体。方法:以9a5b尿囊液为免疫原,接种6周龄BALB/c小鼠,以血凝抑制(HI)和间接免疫荧光(IFA)检测所获得的mAb。结果:成功制备获得NDV血凝素(HN)特异性mAb4株。免疫特性鉴定表明:在这4株mAb中,3H7和3H9株仅具有IFA和HI效价,且呈现ClassI毒株特异性。结论:该抗体材料为NDVClassⅠ和Ⅱ毒株的血清学鉴定提供极大的便利工具,并为NDVHN功能及受体学研究奠定了基础。

新城疫病毒ClassⅠ强毒株磷蛋白在细胞中的表达与定位

根据ClassI新城疫病毒分离株9a5b编码序列设计特异性引物扩增P蛋白基因，原核表达后利用纯化的蛋白免疫BALB／C小鼠制备单克隆抗体，经二次亚克隆后筛选到4株针对P蛋白的单克隆抗体，利用所得单抗进行P蛋白在细胞内定位分析，NDV9a5b株按5M．O．I感染量接种DFl单层细胞，当PI=4h时，P蛋白呈点状弥散分布于细胞浆内；PI=6～8h时，P蛋白聚集于细胞核周围；PI=12h时，P蛋白呈单极化聚集于细胞核一侧；而PI=16h后开始形成合胞体，P蛋白在单个细胞中仍呈现单极分布；当PI=48h时，细胞核已发生碎裂，荧光强度有所减弱。本研究为深入开展P蛋白在病毒增殖以及细胞周期中的作用机制研究奠定了基础。

新城疫病毒ClassⅠ与ClassⅡ毒株交叉血凝抑制试验快速分类

ClassⅠ新城疫病毒(NDV)分离自健康家禽泄殖腔棉拭子,其基因序列与ClassⅡNDV存在很大差异,为了建立简单快速的NDV分类方法,用SPF鸡制备ClassⅠ和ClassⅡ毒株多价抗血清分别与选取的ClassⅠ和ClassⅡ代表毒株进行交叉血凝抑制反应。结果表明所有ClassⅠ毒株比同ClassⅡ毒株的交叉血凝抑制值高8～64(3～6log2)倍;而ClassⅡ毒株与ClassⅡ抗血清的HI效价比同ClassⅠ毒株的交叉血凝抑制值高2～8(1～3log2)倍,结果与基因分型高度一致,说明可以用交叉血凝抑制试验进行初步分类。本研究结果显示,NDVClassⅠ弱毒株血凝性与广泛应用的NDV弱毒疫苗株不同,基因序列分析可以部分解释这种差异,另外可能HN蛋白的空间结构也会影响其与血凝素结合的特性。

新城疫病毒classⅠ和classⅡ微型基因组的构建及其复制效率差异性的比较

为研究新城疫病毒(NDV)微型基因组的复制效率,本实验分别以NDV 9a5b(ClassⅠ)病毒株和La Sota(ClassⅡ)病毒株基因组骨架为平台,插入绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因替代病毒的整个编码区,只保留与病毒复制、转录和病毒包装相关的调控区域Leader和Trailer,构建获得的微型基因组DNA片段反向插入反向遗传载体TVT(0.0)中,从而构建了两株病毒的微型基因组质粒。同时,将相应病毒株的NP、P和L 3个基因分别克隆至pCI-neo载体中,构建3个辅助质粒的真核表达系统。通过将微型基因组和辅助质粒共转染BSR T7/5T7-5细胞,表明在相同转染条件下,无论使用哪一种辅助质粒,ClassⅡ型微型基因组的报告基因的表达效率均高于ClassⅠ型微型基因组。实验结果显示ClassⅠNDV转录复制系统的运行效率明显低于ClassⅡNDV。

新城疫病毒ClassⅠ强毒株磷蛋白在细胞中的表达与定位

根据Class Ⅰ新城疫病毒分离株9a5b编码序列设计特异性引物扩增P蛋白基因，原核表达后利用纯化的蛋白免疫BALB／c小鼠制备单克隆抗体，经二次亚克隆后筛选N4株针对P蛋白的单克隆抗体，利用所得单抗进行P蛋白在细胞内定位分析，NDV9a5b株按5M．0．I感染量接种DF1单层细胞.

免疫鸡血清新城疫病毒抗体水平与攻毒保护效果的相关性研究

为了明确不同血清新城疫病毒(NDV)抗体水平对鸡的保护效果,本研究采用重组NDV灭活疫苗(A-Ⅶ株)对鸡进行免疫,通过交叉血凝抑制(HI)试验比较A-Ⅶ株与La Sota株间的血清学差异,并采用NDV标准强毒株F_(48)E_(8)和基因Ⅶ型强毒株JSC0804对不同抗体水平免疫鸡进行了攻毒保护试验。结果显示:抗A-Ⅶ株血清用A-Ⅶ株抗原测得的平均HI抗体效价显著高于La Sota株抗原(P<0.01),约高1.5log2,而抗La Sota株血清用La Sota株抗原测得的平均HI抗体效价稍高于A-Ⅶ株抗原,但无显著差异(P>0.05),表明2种疫苗株存在一定的血清学差异。在试验条件下,所有免疫鸡经点眼滴鼻攻毒后均未表现明显临床症状,但存在不同程度的排毒现象,排毒率总体上随抗体效价升高呈逐渐下降趋势。A-Ⅶ株疫苗免疫鸡血清HI抗体效价分别达≥13log_(2)和≥14log_(2)时可完全阻止F_(48)E_8株和JSC0804株排毒。免疫鸡排毒一般仅限于攻毒后5 d内。本研究阐明了免疫鸡的抗体水平和免疫保护效果的相关性,为新城疫免疫控制提供了依据。

表达鸡传染性喉气管炎病毒gD蛋白的重组嵌合型新城疫病毒La Sota株的构建

为构建表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D(gD)的重组新城疫病毒(NDV)La Sota株,本研究将ILTV强毒株gD基因胞外域与NDV F基因信号肽、跨膜域和胞质尾区融合,并插入到含有NDV基因VII型F和HN基因的嵌合型La Sota株感染性cDNA克隆pLa Sota-VIIF/HN的P和M基因之间,将获得的重组感染性克隆pLa Sota-VIIF/HN-gD与辅助质粒pCIneo-NP-P-L共转染BHK-21细胞,拯救出表达gD蛋白的重组嵌合型NDV La Sota株rLaSota-VIIF/HN-gD,并采用血凝试验鉴定正确后,将重组病毒在9日龄SPF鸡胚中连续传至10代,提取10代重组病毒基因组RNA,反转录成c DNA作为模板,以ILTV gD基因插入位点两侧的鉴定引物进行PCR鉴定;采用第10代重组病毒感染BHK-21细胞,以ILTV gD蛋白多克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光试验(IFA);分别对鸡红细胞吸附的重组病毒感染的鸡胚尿囊液上清和从红细胞上解离下来的纯化的重组NDV病毒粒子经western blot鉴定,并对重组病毒对鸡胚的致病性和在鸡胚中的复制动态进行初步研究。PCR结果显示ILTV gD基因能够在重组病毒中稳定存在;IFA和western blot鉴定结果显示,重组病毒能够正确表达ILTV的gD蛋白,而且gD蛋白嵌合表达在重组病毒颗粒上。鸡胚致病性试验和鸡胚中的复制动态试验结果显示,重组病毒保持了La Sota疫苗株的低致病性和良好的复制特性,rLaSota-VIIF/HN-gD的鸡胚平均死亡时间(MDT)为168 h,1日龄雏鸡脑内接种该重组病毒的致病指数(ICPI)为0.20,鸡胚半数感染量(EID_(50))峰值可达10^(-8.66)/100μL。本研究所制备的重组病毒r LaSota-VIIF/HN-gD为研制基因VII型NDV和ILTV的二联活疫苗奠定了基础。

新城疫病毒La Sota株热损伤靶点的初步分析

为探索新城疫病毒不耐热毒株La Sota热损伤靶点,以期为新型耐热疫苗研发提供理论依据,试验通过检测加热前后La Sota株的吸附及内化功能,考察纤突蛋白HN和F活性变化情况,以及核衣壳完整性,综合分析新城疫病毒热损伤靶点。结果显示:37℃加热24 h后F蛋白活性首先受损,表现为内化功能显著下降(0.01<P<0.05),56℃加热15 min后HN和F蛋白活性几乎丧失,表现为吸附及内化功能均极显著下降(P<0.01);高温加热后,病毒核衣壳完整性显著降低,病毒粒子破损且失去纤突结构,表现为吸附及内化功能极显著下降(P<0.01)。研究表明,La Sota株热损伤靶点与加热温度和时间密切相关:中温下(≤56℃)病毒热损伤靶点主要在HN和F蛋白,高温下(≥80℃)病毒热损伤靶点为纤突蛋白和核衣壳;纤突蛋白的热敏感性高于核衣壳,且F蛋白受损早于HN蛋白。

新城疫病毒Mukteswar株感染鸡巨噬细胞入胞及胞内转运途径研究

新城疫病毒(NDV)可以通过多种内吞途径入侵不同宿主细胞并在内体中逃逸从而避免被宿主天然免疫系统“追踪”。为探究NDV中等毒力疫苗株Mukteswar感染鸡巨噬细胞(HD11)的入胞和胞内转运途径,本研究利用Dynasore、CPZ、MβCD、Baf A1预处理细胞,然后感染NDV Mukteswar株,通过Westem blot和IFA检测NDV NP蛋白的表达变化。结果显示Dynasore、MβCD和Baf A1处理后NP的表达水平降低,表明NDV入侵HD11细胞是利用小窝蛋白介导的内吞途径,且依赖动力蛋白、胆固醇和pH。通过过表达和干扰试验检测调节不同内体囊泡类型运输的Rab蛋白(Rab5、Rab7、Rab11)对NDV感染HD11细胞的影响,结果发现Rab7的表达对NDV感染无影响,而过表达Rab5和Rab11促进NDV感染,表明是由Rab5、Rab11而不是Rab7调节NDV的转运。本研究丰富了NDV入侵宿主免疫细胞的途径及胞内转运的研究,并为全面阐明NDV感染机制提供了理论基础。

重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗和鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群4型)三联灭活疫苗联合免疫效果研究

为评价重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗和鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群4型)三联灭活疫苗混合后的联合免疫效果,试验将120只11日龄健康商品代黄羽肉鸡随机分成4组,设混苗联合免疫组、分点免疫组和单苗免疫组,分别接种疫苗,检测免疫前和免疫后14、21、28和35 d鸡血清中特异性抗体水平,评估两种疫苗混合后联合免疫的安全性和免疫效果。结果显示:免疫后1周内各组鸡精神、食欲、呼吸等生理活动均无异常;混苗联合免疫组免疫后14 d,6种病原抗体滴度均升高,免疫后21 d均达到理想水平,免疫后28 d抗体滴度均高于5 log2;混苗联合免疫组抗体水平和抗体消长规律与其他组基本一致。研究表明,两种禽流感疫苗混合后联合免疫的安全性和免疫效果与单苗免疫相当,无干扰现象,可减少鸡群应激,节省人工,为养禽场免疫程序优化提供参考。

六株鹅源新城疫病毒全基因序列分析及对雏鹅的致病性

为了解广东地区鹅源新城疫病毒(NDV)遗传进化及致病性情况,于2019年从广东肇庆、佛山地区疑似NDV感染鹅的组织病料中进行鹅源NDV分离鉴定并选取一株MDT最小的毒株进行病毒对雏鹅的致病性试验。结果显示:共分离6株Ⅻb亚型鹅源NDV毒株,6株毒株间核苷酸和氨基酸相似性最高,但与基因Ⅶ型、La Sota等常用疫苗株相似性较低。F蛋白和HN蛋白部分功能位点氨基酸残基出现不同程度的变异。致病性试验结果表明基因Ⅻb亚型Goose/GD/F424/2019毒株对雏鹅有较强的致病性,死亡率高达87.5%,并出现脾脏肿大,呈“树枝状”样充血、腺胃乳头出血、十二指肠黏膜出血、胰脏变性出血、脑组织充血及水肿等典型病理变化症状。研究表明:从广东地区分离的6株鹅源NDV均是Ⅻb亚型且对雏鹅有较强的致病性,为进一步研究广东地区鹅源NDV流行、进化及相关疾病的防控奠定基础。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

基于转录组测序的金银花提取物抗鸽源新城疫病毒感染的作用机制研究

[目的]探究金银花提取物抗鸽源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染的作用机制。[方法]选取未接种NDV疫苗的健康28日龄美国王鸽40只,适应性饲养7 d,于35日龄随机分为金银花预防(KO)组和攻毒对照(OE)组,每组20只。KO组试验鸽于35日龄开始在饮水中添加1.2%的金银花提取物,持续饮用7 d,42日龄时肌肉注射HA效价为5log2的鸽源NDV Pi/NJ/CH/4416/2016株0.5 mL/只;OE组试验鸽于35日龄进入正式试验,正常饮水,42日龄时肌肉注射HA效价为5log2的鸽源NDV Pi/NJ/CH/4416/2016株0.5 mL/只。攻毒7 d后,每组选取3只试验鸽采集脾脏组织样本制备组织切片,同时提取总RNA构建转录组文库,利用转录组测序(RNA-sequencing,RNA-Seq)技术进行差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)鉴定、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。随机选取4个显著差异表达基因,利用qRT-PCR验证测序结果。[结果]OE组鸽子脾细胞核异常增大且出现白色空泡,并伴有大量粒细胞浸润,而KO组脾脏组织仅见较多白色空泡和少量粒细胞浸润,未见脾细胞核异常增大。利用RNA-Seq技术从KO组鸽脾脏中共鉴定出374个DEGs,其中,112个基因表达显著上调,262个基因表达显著下调。GO功能富集分析显示,共有875个DEGs富集到312个GO条目,其中,生物学过程富集到149个条目,细胞组成过程富集到33个条目,分子功能过程富集到130个条目。KEGG通路富集分析显示,共有226个DEGs主要被富集在信息传递通路、代谢通路、天然免疫相关通路、细胞凋亡通路等93条KEGG信号通路。qRT-PCR验证结果显示,从DEGs中随机选取的4个显著差异表达基因(LOC110360702、LOC110360688、SFRP5、CHAD)的相对mRNA丰度变化趋势与RNA-Seq结果显示的4个基因变化趋势一致。[结论]金银花提取物通过激活宿主的信息传递、代谢调节及免疫应答等重要生理过程发挥抗鸽源NDV感染作用。研究结果为进一步探究鸽源NDV感染中免疫应答的分子机制提供了科学依据。

重组新城疫病毒rL-RVG抑制Nrf2-GCLC-GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡

目的探讨重组新城疫病毒(recombinant Newcastle disease virus,rL-RVG)是否通过Nrf2-GCLC-GPX4通路引发胃癌细胞铁死亡。方法培养人胃癌HGC-27细胞,分别用rL-RVG、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、PBS溶液(对照组)处理HGC-27细胞后,用CCK-8、Transwell侵袭、细胞划痕实验检测胃癌HGC-27细胞的增殖、侵袭、迁移能力。加入铁死亡促进剂(erastin)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)促进剂(TBHQ)及抑制剂(ML385)作为干预组,脂质氧化试剂盒检测各组丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;DCFH-DA荧光探针及流式细胞仪检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;Western blot、免疫荧光法检测Nrf2-GCLC-GPX4通路相关蛋白表达情况。结果与对照组比较,rL-RVG和NDV处理后,细胞的存活率均下降,呈剂量、时间依赖性,且rL-RVG处理组较为显著(P<0.05);NDV和rL-RVG处理组胃癌HGC-27细胞迁移、侵袭能力均受到抑制,后者较前者抑制更明显(P<0.05);与对照组比较,病毒组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量上升(P<0.05),rL-RVG组上升或下降的趋势较NDV组明显,且erastin组SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P<0.05);与对照组比较,TBHQ组、ML385组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达分别上升、下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P<0.05);与rL-RVG组比较,rL-RVG+TBHQ组、rL-RVG+ML385组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达分别上升、下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P<0.05)。结论重组新城疫病毒(rL-RVG)可通过Nrf2-GCLC-GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡的发生,抑制肿瘤细胞的生长。

鉴别鸽新城疫病毒野毒株与疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法的建立

为建立一种能够区分鸽新城疫病毒(NDV)野毒株与常用新城疫疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法(RAA),本研究针对基因Ⅵ型鸽源NDV和La Sota的NP基因设计出1对特异性引物,经过优化引物浓度、反应时间、反应温度,建立了能够区分鸽NDV野毒株与La Sota的RAA检测技术。对其特异性、敏感性和重复性进行测试,并应用建立的方法检测了45份临床样品。结果显示:该技术在15℃~39℃的恒温条件下,可于15 min内完成对目标基因的扩增;对禽支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和衣原体等常见病原的检测结果均为阴性;重组质粒标准品检测下限为39.5 copies/反应;45份临床病死鸽样品的检测,检出28份阳性,与常规PCR方法的检测结果一致。本研究结果说明建立的RAA方法可应用于临床样品的快速检测。

金银花对鸽新城疫病毒感染肉鸽器官组织、血清免疫指标及抗氧化能力的影响

目的评估金银花对鸽新城疫病毒(NDV)感染肉鸽器官组织、血清免疫指标及抗氧化能力的影响,以期为金银花作为鸽新城疫的潜在预防和治疗药物提供科学依据。方法将80只35日龄的健康鸽(未免疫NDV疫苗)随机分为2个试验组和2个对照组,即金银花预防组(P)、金银花治疗组(H)、攻毒对照组(V)和空白对照组(N)。P组和H组分别于35日龄、42日龄添加1.2%金银花提取物饮水7 d,P组、H组和V组同时于42日龄肌内注射鸽NDV4416毒株(0.5 mL/只)。于攻毒后第7天每组随机剖杀3只鸽子,观察并记录脑、肝、脾、肺的剖检病变和组织病变。于攻毒后第3、7天每组随机采集3只鸽子的血液,用ELISA和生化法测定血清免疫指标(IgA、IgG、C3、IFN-γ)和抗氧化能力指标(SOD、T-AOC)含量。结果相较于V组,P组和H组鸽子脑、肝、脾、肺的剖检病变和组织病明显减少,血清特异性免疫指标(IgA、IgG)分泌水平大体升高,非特异性免疫指标(C3、IFN-γ)和抗氧化能力指标(SOD、T-AOC)分泌水平均显著上升(p<0.05)。结论使用1.2%金银花提取物作为抗病毒药物可有效缓解鸽NDV对肉鸽器官组织造成的损伤,增强机体免疫力,提高机体抗氧化能力,其中金银花预防组的效果优于治疗组。

6株鸽源新城疫病毒广东分离株F、HN基因的克隆及遗传进化分析

为研究广东省鸽源新城疫病毒(NDV)的遗传进化规律,试验于2021—2022年从广东6家疑似感染NDV的鸽场采集病鸽临床样品,进行RT-PCR诊断、病毒分离鉴定和动物回归试验,并对分离毒株进行生物学毒力测定以及F基因、HN基因的同源性和遗传进化分析。结果显示:共分离到6株鸽源NDV,对幼鸽进行分组攻毒14 d后,发病率均为100%,死亡率为60%~80%;6株毒株的F蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117/112R-R-R-K-R-F117,具有NDV强毒株的典型分子特征,和分离毒株ICPI的测定结果共同表明6株毒株均为强毒株;6株毒株均为NDV的ClassⅡ基因Ⅵ.2.1.1.2.2型;与传统疫苗株La Sota的同源性较低,且F、HN蛋白氨基酸出现多处位点变异。研究表明,广东省鸽源NDV流行以Class Ⅱ基因Ⅵ.2.1.1.2.2型为主,常用的疫苗株La Sota可能对广东地区流行的鸽源NDV保护效果不佳。

4株不同基因型新城疫病毒毒力测定及与商品疫苗株抗原性比较

为了探究不同基因型和不同来源4株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)及现有商品疫苗株的抗原性差异,测定4株新城疫病毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间(mean death time,MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI),分别制备油乳苗,再与商品疫苗NDV La Sota株、A-Ⅶ株分别接种SPF鸡,收集单因子血清进行HI交叉试验和细胞交叉中和试验。结果显示,基因Ⅵ型NDV B27为中等毒力毒株,基因Ⅶ型NDV B9、基因Ⅸ型NDV B14、基因Ⅻ型NDV GX01为强毒株;HI交叉试验结果显示,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅸ型NDV B14抗原同源性为0.64,抗原性差异微小,其他毒株之间的抗原同源性为0.69~0.99,抗原差异不大;细胞交叉中和试验结果显示,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅸ型NDV B14抗原同源性为0.42,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅱ型疫苗株La Sota抗原同源性为0.47,抗原差异较大,其余毒株及疫苗株La Sota之间抗原差异微小。试验结果可为后续筛选NDV疫苗候选株提供参考。

重组新城疫病毒rL-RVG通过p53-YAP1-ACSL4通路诱导肺腺癌细胞铁死亡

目的旨在探究重组新城疫病毒rL-RVG是否通过p53-YAP1-ACSL4通路影响肺腺癌细胞铁死亡。方法体外培养人肺腺癌细胞系A549、PC9,将处于对数增殖期的细胞分为对照组(NC组)、新城疫病毒感染组(NDV组)、重组新城疫病毒感染组(rL-RVG组)、铁死亡诱导剂组(Erastin组)及铁死亡抑制剂组(NAC组)。在病毒感染和铁死亡诱导剂、抑制剂干预后,通过CCK-8、划痕实验和Transwell来检测细胞的功能学变化,包括细胞活力、迁移能力和侵袭能力;光学显微镜观察细胞形态改变。使用流式细胞术和荧光显微镜来测定细胞中ROS的含量,用酶标仪对MDA含量进行测定,通过Western blot和实时荧光定量PCR来检测铁死亡相关蛋白p53、YAP1及ACSL4的表达。结果与NC组相比,rL-RVG组细胞生长、迁移及侵袭能力明显下降(P<0.01);ROS及MDA水平升高且与铁死亡诱导剂组相比含量显著提高(P<0.01),铁死亡抑制剂干预后含量均减少(P<0.01);铁死亡关键蛋白p53、YAP1、ACSL4表达量明显升高(P<0.01);Si-RNA敲减YAP1和ACSL4后相应蛋白的表达量减少(P<0.01),并且ROS和MDA含量均减少(P<0.01)。结论rL-RVG可以有效地阻止肺腺癌细胞的增殖、迁移和扩散,并且能够通过p53-YAP1-ACSL4轴增加脂质过氧化物和细胞活性氧的含量,最终诱导肿瘤细胞铁死亡。