新城疫病毒F_(48)E_8株 HN基因在杆状病毒系统中表达

目的 采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48 E8株HN基因表达。方法NDV F48 E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭载体Bacmid中,经筛选获得重组Bacmid HN转染到Sf-9昆虫细胞,并进行检测。结果 表达产物经SDS-PAGE、Westem blot检测获得蛋白特异带,相对分子质量约63000。结论NDVF48E8株HN基因能通过新型杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中进行表达,表达量约为细胞总蛋白的10％。

鸡新城疫病毒F48E9株血凝素神经氨酸酶基因免疫诱导免疫保护的初步研究

将我国新城疫病毒标准强毒F4 8E9株的血凝素 神经氨酸酶基因克隆于真核表达载体 pcDNA3 中 ,进行鉴定后筛选阳性质粒。将此阳性质粒进行大量法提取并纯化后作为基因疫苗以每只鸡 10 0 μg的剂量肌肉接种 4 5日龄SPF鸡 ,并以 pcDNA3 空质粒作为对照。结果表明 ,新城疫基因疫苗能够诱导机体产生新城疫病毒特异的血清IgG抗体反应 ,但产生抗体所需的时间较长 ,抗体滴度的增加较为缓慢。人工接种新城疫强毒后 ,基因疫苗免疫组 4 / 6的鸡得到保护 ,而且保护鸡具有明显的抗体反应 ,2只鸡未得到保护 ,但其死亡时间明显迟于对照组鸡 ,死亡鸡具有典型的新城疫病毒感染鸡的病理形态学变化。

新城疫病毒中国标准强毒F_(48)E_8株融合蛋白的结构

对新城疫病毒（ＮＤＶ）中国标准强毒Ｆ４８Ｅ８株融合蛋白的结构进行了分析．该融合蛋白的前体Ｆ０由５５３个氨基酸组成，在第１１６和１１７位氨基酸处被酶切成Ｆ１和Ｆ２亚单位．酶切激活部位序列为ＲＲＱＲＲ↓Ｆ，第１１７位氨基酸为Ｆ，具有ＮＤＶ强毒的特征．Ｆ０上有３个疏水区，其功能分别代表信号肽区、融合诱导区和跨膜结构区．Ｆ０的可糖基化部位有６个．并比较了Ｆ４８Ｅ８株和国外强毒株的氨基酸同源性，与Ｍｉｙａｄｅｒａ株、ＴｅｘａｓＧＢ株的同源性分别为９３．６４％和９２．４１％．

新城疫病毒F48E9株病毒结构蛋白的分析

采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、激光扫描技术、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和糖蛋白染色方法对新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ９株的结构蛋白进行了分析，结果表明，它具有ＮＤＶ的典型结构特征。

鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析

根据GenBank登录的鸡新城疫病毒NP基因序列设计引物,利用RT-PCR对F48E9强毒株NP基因进行扩增,将扩增产物经纯化后连入pMD18-T载体,通过PCR和酶切鉴定出阳性重组质粒,经测序后获得F48E9 NP基因序列。经分析发现该基因的ORF总长为1 470 bp,编码489 aa,NP蛋白有4个高度保守的Cys位点,分别位于第55、78、139、213位,且在401～440位和461～481位区域变异较大。将F48E9株与19株参考毒株的相应序列进行比较得到核苷酸序列同源性为87.9%～92.3%,氨基酸序列同源性较高,为92.2%～98.0%,遗传进化分析表明F48E9株相对独立,与参考毒株的遗传距离较远。

新城疫病毒F_(48)E_9株NP基因的克隆与序列分析

根据NDVNP蛋白已知基因序列设计合成了一对引物 ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株NP基因 15 98bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger′s双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株NP基因片段的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 88.2 %。至此 ,我们获得了F4

新城疫野毒株与F_(48)E_9强毒株对不同抗体水平雏鸡的感染试验

应用新城疫野毒株与F48E9标准强毒株对母源抗体效价分别为 8.5 0、6.0 0和 4.0 0log2的雏鸡进行了攻毒试验。结果 ,新城疫野毒株的感染致死率依次为 2 0 %、10 0 %和 10 0 % ;F48E9标准强毒株的感染致死率依次为 0、10 %和10 0 %。提示 ,在目前新城疫流行日益复杂的情况下 。

新城疫病毒F48E9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。

新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF。鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFastBacI载体中,得到重组转移载体pFast-NDF。然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF。再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用。动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体。本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础。

新城疫病毒强毒株F48E9致病性细化分型的鉴定

为了确证我国标准速发型新城疫强毒株F48E9致病性的细化分型,分别采用泄殖腔涂抹、泄殖腔注射、点眼滴鼻和静脉注射4种感染途径,用高、低2种剂量对SPF鸡进行感染,综合分析临床症状和病理变化。结果显示：各组均出现典型神经症状,并且伴随呼吸道症状和下痢,其中高剂量组尤其是静脉注射途径,病程较短,出现明显神经症状后1-2 h死亡,病理变化不明显;低剂量组发病平缓,神经症状呈明显的渐进性,其中以点眼滴鼻途径最为明显;各感染途径剖检观察到明显的脑部及肠道出血;综合分析判定F48E9株为嗜神经型速发型强毒。同时,针对强毒株致病性的细化分型,建议采取点眼滴鼻途径和低剂量方式,综合分析临床症状和病理变化进行鉴定。对速发型新城疫病毒的细化分型鉴定能够进一步为新城疫的鉴别诊断,病毒的组织嗜性、致病机理研究提供重要的基础依据。

鸡新城疫标准强毒感染鹅试验

用鸡新城疫中国标准强毒F48E8及国外标准强毒Hert33、AG68人工感染鹅，可以使鹅感染发病，F48E8攻毒组发病率100％，死亡率50％（9／18）；AG68、Hert33攻毒组发病率明显低于F48E8攻毒组和JS2／98／Goose攻毒组，死亡率分别为6％（1／15）和0％（0／15）。对照组健康，且扑杀时平均体重明显高于攻毒组。实验证明：新城疫中国标准强毒株F48E8等毒株可以使鹅发病，症状和病变都与文献中所报道的鹅副粘病毒病相同。

以rLaSota为骨架构建表达强毒株HN蛋白的嵌合体新城疫病毒

新城疫病毒(NDV)的HN蛋白是一个多功能蛋白,具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性,在病毒感染过程中扮演重要角色。本研究利用反向遗传操作技术,将NDV强毒株F48E9的HN基因替换弱毒株rLaSota的HN基因,获得嵌合病毒rL-F48E9HN。收获病毒尿囊液,提取基因组RNA,进行序列分析,结果显示嵌合病毒基因组的HN基因获得了正确替换。嵌合病毒在鸡胚内的生长特性与亲本株LaSota一致,与F48E9的生长特性相差甚远。嵌合病毒红细胞吸附性明显增强,较rLaSota株增加51%,而细胞融合作用无明显变化。rL-F48E9HN的鸡胚平均致死时间(MDT)为148 h,脑内致病指数(ICPI)为0.43,静脉接种致病指数(IVPI)为0,说明rL-F48E9HN的毒力仍然属于弱毒力范围,而没有达到中等毒力或者强毒力。