携带新德里金属β-内酰胺酶的猪源大肠杆菌全基因组测序及植物提取物药物筛选

为了解大肠杆菌携带新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase,NDM)NDM耐药基因情况及筛选敏感植物提取物。采用16S rRNA菌种鉴定,PCR筛查菌耐药基因,bla NDM、bla TEM和AmpC酶耐药基因的确认,全基因组测序,BLAST和MEGA软件对序列进行生物信息学分析、系统进化树分析、NDM亚型鉴定和6种植物提取物药敏药物筛选研究。结果表明,从2021年(1-12月)临床猪腹泻病例中分离鉴定的91株大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中鉴定出1株同时携带新德里金属β-内酰胺酶NDM4、NDM5和β内酰胺酶blaTEM、AmpC酶的大肠杆菌(HN2187)。对其进行11种抗生素和6种植物提取物药物敏感性测试,结果显示HN2187菌株对其均耐药。而HN2187对血根碱、贯叶连翘提取物敏感,对黄芩、姜黄素、千里光和大蒜提取物耐药。HN2187产B类酶,携带NDM4、NDM5、bla TEM、AmpC酶耐药基因,其中bla NDM-4位于质粒pNDM4-HN2187(Plasmid B)上,bla NDM-5位于质粒pNDM5-HN2187(Plasmid A)上,bla TEM1位于质粒pTEM1-HN2187(Plasmid B)上,AmpC酶耐药基因位于染色体上,分别介导bla NDM-4、bla NDM-5、bla TEM和AmpC耐药基因,是耐药菌传播的重要载体。以上研究表明,携带NDM4和NDM5的多重耐药菌已在养殖场传播和流行,应加强该类耐药基因的流行调查、监测和新药物研究,为临床超级细菌和多重耐药菌感染的流行和防治提供理论基础。

海南2株大肠埃希菌中发现新德里金属β-内酰胺酶1

目的分离和确认2株耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌(E.coli)携带新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)基因。方法用法国生物梅里埃公司API20E生化鉴定条和Vitek 2全自动细菌鉴定仪和配套GNS卡鉴定出2株耐亚胺培南和美罗培南的E.coli;并对其进行亚胺培南/亚胺培南+EDTA纸片法协同试验、IP/IPI E-test试条法协同试验检测金属β-内酰胺酶,对目的菌株进行NDM-1基因PCR特异性扩增,扩增产物测序鉴定;对目的菌株进行质粒接合转移试验分析其耐药机制。结果 2株测试菌亚胺培南/亚胺培南+EDTA纸片法协同试验、IP/IPI E-test试纸条法协同试验均为阳性,PCR扩增及测序证实为携带NDM-1耐药基因;体外药敏试验除对多黏菌素B和替加环素敏感外,其他广谱抗菌药物包括头孢菌素类、β-内酰胺类加酶抑制剂类、碳青霉烯类、氨基糖苷类和喹诺酮类均呈现高水平耐药,2株接合子E.coli对所有β-内酰胺类药物的MIC值高于受体菌E.coli J53,其中对美罗培南和亚胺培南MIC均提高了8倍以上,头孢他啶及头孢曲松则提高了64倍以上。结论海南地区出现携带NDM-1基因的E.coli,该基因可在不同菌株之间传递。

多光谱方法结合理论计算探究金属β-内酰胺酶SMB-1与亚胺培南之间的相互作用

金属β-内酰胺酶(MβLs)可以水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素,这是导致细菌感染治疗中产生耐药性的主要机制。迄今为止,由于缺乏临床批准的抑制剂,这已成为全球关注的问题。最近来自粘质沙雷氏菌的SMB-1被发现是一种新型的B3亚类MβL,它可以灭活几乎所有含β-内酰胺环的抗生素。为了明确SMB-1与β-内酰胺类抗生素的特异性分子识别和作用机制,采用内源性荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱及分子对接方法对碳青霉烯类抗生素亚胺培南(IMIP)与金属β-内酰胺酶SMB-1之间的相互作用机制进行探究。猝灭光谱结果表明IMIP可以使SMB-1内源性荧光猝灭,且猝灭机制为动态和静态组合猝灭,其中静态猝灭为主,结合常数K a为16.11×10^(3)L·mol^(-1)(277 K),表明两者之间具有很强的结合力;根据Van’t Hoff方程得出结合过程中的热力学参数ΔG<0,ΔH=-79.65 kJ·mol^(-1),ΔS=-238.69 J·mol^(-1),说明两者的结合是由焓变和熵变共同驱动的,且氢键和范德华力为主要作用力;同步荧光结果中,随着IMIP浓度的增加,SMB-1最大发射波长均发生蓝移4.4和2.9 nm,表明Tyr和Trp残基参与IMIP与SMB-1的结合过程;三维荧光光谱中IMIP加入后,SMB-1的Peak B和Peak C强度显著降低,表明SMB-1与IMIP作用之后的微环境和构象发生了改变,与同步荧光结果一致。分子对接结果中IMIP的β-内酰胺环进入SMB-1的结合口袋,而侧链因空间位阻效应位于活性口袋的外部,表明SMB-1主要是识别IMIP的核心结构,与其R2侧链的作用较弱;与IMIP参与作用的氨基酸残基包括Ser175,Thr177,Gln157,His215和Glu217,表明这些氨基酸残基与活性部位的两个锌离子是设计具有强亲和力的SMB-1抑制剂的关键因素;结合自由能也为负值,表明两者的结合是一个自发放热的过程,与荧光结果一致。该研究提供了对SMB-1与IMIP的识别和结合的见解,可能有助于设计β-内酰胺酶新底物和开发对超级细菌具有抗性的新抗生素。

新德里金属-β-内酰胺酶-1基因流行病学研究进展

近些年，临床分离的细菌对常规抗生素正显示出越来越强的耐药性，除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌外，多重耐药革兰阴性菌的出现也威胁到了公众健康。《柳叶刀——传染病》期刊中的关于携带有新德里金属-β-内酰胺酶-1（NewDelhimetallo-β-lactamase1，NDM-1）基因的细菌的报道更是成为关注的焦点[1]。本文对该基因及其流行病学研究进展加以综述。

新德里金属-β-内酰胺酶1(超级细菌)

超级细菌的由来根据文献记载,一名59岁男性印度籍瑞典人于2007年11月回到印度,2007年12月在新德里一家医院做了手术,2008年1月8日回到瑞典。在新德里住院期间,他使用了阿莫西林、丁卡那霉素、加替沙星、甲硝唑等抗生素。2008年1月9日,从他的尿液中分离到一株肺炎克雷伯菌。

产金属β内酰胺酶大肠埃希菌感染3例

耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌(CRGNB)的传播是一个全球性的公共卫生问题。CRGNB分离株通常具有广泛的耐药性,导致抗菌治疗选择有限,死亡率升高。在美国,碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(CRE)每年引起超过13000例感染,并导致超过1000人死亡。CRE是指至少对一种碳青霉烯类抗生素耐药或产生碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌,分为非产碳青霉烯酶和产碳青霉烯酶两类[1]。常见的碳青霉烯酶包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)、新德里金属β内酰胺酶(NDM)、亚胺培南水解金属β内酰胺酶(IMP)、维罗纳整合子编码的金属β内酰胺酶(VIM)和苯唑西林酶(OXA-48)。NDM是肠杆菌科细菌中最常见的金属酶,主要见于大肠埃希菌、阴沟肠杆菌。我国碳青霉烯类耐药大肠埃希菌中产NDM比例超过70%,以NDM-1/5为主[2]。在制定抗感染方案时,除了考虑病原菌对抗菌药物的敏感性,还需要考虑抗菌药物在感染部位的组织浓度。本研究对福建医科大学附属泉州第一医院收治的产金属β内酰胺酶大肠埃希菌所致腹腔感染、尿路感染、骨髓炎的3个病例进行回顾性分析,总结其临床特征,为临床诊治提供参考。

2株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌发现新德里金属β-内酰胺酶基因

目的调查新德里金属β-内酰胺酶1基因(New Delhi metallo-β-lactamase 1,blaNDM-1)在我院碳青霉烯类抗菌药物耐药肠杆菌科细菌中的流行状况。方法收集并鉴定临床分离碳青霉烯类抗菌药物耐药肠杆菌科细菌51株。药物敏感试验用琼脂稀释法;改良Hodge试验检测碳青霉烯酶;亚胺培南和亚胺培南+EDTA双纸片协同法检测金属β-内酰胺酶;PCR法检测blaNDM-1基因及其他主要的碳青霉烯酶基因(blaVIM、blaIMP、blaSIM、blaKPC、blaGES、blaSME、blaOXA-48),PCR扩增产物进行DNA测序分析。通过质粒转化试验来确定耐药基因的转移性。结果 1株阴沟肠杆菌和1株大肠埃希菌检出blaNDM-1基因,其他碳青霉烯酶基因阴性。2株细菌改良Hodge试验均为阳性,均产金属β-内酰胺酶,对所有的β-内酰胺类抗菌药物均耐药。耐药基因质粒转化试验阳性,转化子blaNDM-1基因检测阳性,并对青霉素类、头孢菌素类以及碳青霉烯类抗菌药物产生较高的耐药性。结论在本地区首次发现blaNDM-1基因,临床工作者应高度重视,加强对此类耐药基因的监测。

产新德里金属-β-内酰胺酶耐药菌的相关文献计量分析

目的从文献计量学角度对国内外产新德里金属-β-内酰胺酶(NDM-1)相关文献进行分析。方法检索至今的Pubmed、Embase、CNKI、维普和万方数据库中NDM-1相关文献,对纳入研究的文献进行统计分析。结果纳入研究的文献共57篇。目前有超过20个国家或地区有撰文报道该耐药菌,相关病例报告主要集中在印度和欧洲部分国家。结论产NDM-1细菌全球流行趋势明显,国外已建立较为完善的监控体系并进行了初步研究。

产Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶耐药菌的研究概况及应对措施

2008年首次在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中确认了Ⅰ型新德里金属β内酰胺酶（New Delhi Metallo-β-lactamase1，NDM—1）。目前产NDM-1酶细菌在印度、英国、美国、加拿大、荷兰、澳大利亚以及中国等国均有报道。研究发现至少一例NDM-1阳性菌对所有已知的抗生素具有耐药性。该文简要介绍了NDM-1耐药菌的发现、发展过程及其耐药性情况，基因特点以及NDM-1阳性菌的应对措施.

产新德里金属β-内酰胺酶耐药菌感染治疗的研究进展

新德里金属β-内酰胺酶(NDM)自2009年首次被报道以来,产NDM耐药菌已在全球范围流行并引发多种类型感染,有效控制和治疗产NDM耐药菌感染具有重要的现实意义。然而,目前并没有确切的关于产NDM耐药菌的临床治疗方案。我们对产NDM耐药菌感染的治疗研究现状做简要综述,为产NDM耐药菌感染的控制和临床治疗提供科学合理的依据和指导。

新德里金属β内酰胺酶-1序列和抗药性的生物信息学分析

在2009年报导的新德里金属-β-内酰胺酶-1（NDM-1）是“超级细菌”的一种主要的抗药物酶，具有通过基因重组在不同物种间转移的潜力，而且它具有广谱耐药性，目前已知的抗生素中，仅替加环素对其有抑制作用。本文旨在通过生物信息学技术探索NDM-1的基因重组的方式，并利用分子对接方法研究替加环素抑制NDM-1的分子机制。通过对一系列金属-β-内酰胺酶的氨基酸序列的进化树分析，发现三种来自海洋生物的蛋白与NDM-1具有较近的功能类似性，而相应编码基因的进化树分析发现仅其中一种与NDM-1有较近的进化距离。GC含量分析也发现NDM-1上游100～350bp剧烈波动，而在编码区段与该种基因的GC含量较为相似。因此认为NDM-1基因可能通过该基因水平转移的获得其特殊的功能。另外，通过半柔性分子对接，对NDM-1与替加环素的优势结合构象的潜在氢键进行分析，并与另外5种抗生素与NDM-1的对接结果进行比较，初步确定替加环素对于NDM-1蛋白存在竞争抑制优势，从而为NDM-1抑制剂的设计提供有价值的信息。

产新德里金属β-内酰胺酶-1醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体碳青霉烯酶、外膜孔蛋白和外排泵相关基因检测

目的研究临床分离的产新德里金属β-内酰胺酶(NDM)醋酸钙-鲍曼不动杆菌(Acb)复合体耐碳青霉烯类药物的机制。方法通过VITEK-2 compact全自动微生物分析仪鉴定、42℃生长实验、聚合酶链反应(PCR)检测OXA-51-like基因,rpoB基因序列测定对收集的耐碳青霉烯类Acb复合体进行菌种鉴定。利用PCR筛查是否携带NDM基因,通过测序确定NDM型别并进一步检测其他碳青霉烯酶相关基因、外膜孔蛋白基因和外排泵基因。利用DiversiLab细菌DNA指纹图谱分析系统对产NDM-1的Acb复合体进行基因分型。结果共筛选出10株产NDM-1的Acb复合体,其中5株为Pittii不动杆菌,3株为Nosocomialis不动杆菌,2株为鲍曼不动杆菌。在5株Pittii不动杆菌中,2株检出OXA-58-like基因,5株检出外膜孔蛋白oprD基因和外排泵adeI,adeK基因,4株检出adeJ基因。3株Nosocomialis不动杆菌中均检出外膜孔蛋白carO和oprD基因以及外排泵adeB,adeI,adeJ和adeK基因。2株鲍曼不动杆菌中均检出外膜孔蛋白carO基因以及外排泵adeB,adeI,adeJ和adeK基因,1株检出外膜孔蛋白oprD基因,1株检出OXA-23-like基因。鲍曼不动杆菌、Pittii不动杆菌和Nosocomialis不动杆菌基因分型结果均分为两型。结论在福建省Pittii不动杆菌中同时检出NDM-1和OXA-58-like基因,在鲍曼不动杆菌中同时检出NDM-1和OXA-23-like基因。本地分离的Nosocomialis不动杆菌与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药可能与AdeIJK外排泵及NDM-1酶作用有关;Pittii不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药则可能是由外膜孔蛋白CarO缺失、AdeIJK外排泵及NDM-1酶共同作用的结果。

产新德里1型金属β-内酰胺酶鲍曼不动杆菌的耐药性分析及传播机制

目的研究产新德里1型金属β-内酰胺酶(NDM-1)鲍曼不动杆菌的耐药性及传播机制。方法收集南昌大学第一附属医院2013年1月至2015年1月各种临床标本中分离碳青霉烯类抗生素耐药的鲍曼不动杆菌440株作为实验菌株,采用法国梅里埃VITEK 2compact全自动细菌鉴定仪对菌株进行鉴定及药物敏感性分析;采用改良的Hodge试验筛选产碳青霉烯酶阳性菌株,同时对试验菌株的blaNDM-1基因进行测序,测序结果BLAST比对分析;采用肠杆菌科基因间重复一致序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)对菌株进行基因分型;对阳性株进行质粒接合试验,并对接合后菌株提取DNA进行PCR扩增检测其耐药基因,运用质粒图谱和质粒酶切图谱研究其传播机制。结果 440株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆中检出NDM基因阳性率为2.5%(11/440),经测序确认为blaNDM-1基因。阳性菌株呈现多重耐药现象,且每株菌均携带多种耐药基因,其中blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、qnrB、qnrS、acc(6′)-Ib、rmtB、armA等为最常见共同携带耐药基因。11株blaNDM-1基因阳性菌质粒接合试验成功2株,采用PCR技术扩增接合成功菌株的blaNDM-1基因。质粒图谱分析发现blaNDM-1基因位于一大小约46kb质粒上。结论南昌大学第一附属医院产NDM-1)型鲍曼不动杆菌携带多种耐药基因,其中blaNDM-1基因主要位于质粒上,可通过接合方式传播,存在克隆传播现象,易于在菌株间流行。

新德里金属-β-内酰胺酶的流行现状与水解机制分析

随着抗生素的乱用与滥用,细菌的耐药性及其机制也不断发展,其中金属-β-内酰胺酶(MBLs)介导的严重甚至多药耐药性,使得传统抗生素如青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等已无法应对这些耐药菌引起的感染,给人类的健康安全也带来了日益严重的威胁。了解金属酶耐药基因的检出和传播状况,深入研究金属酶耐药机制,对于及时诊断、合理用药以及预防新的耐药菌等具有重大意义。本文介绍了新德里金属β-内酰胺酶的流行现状及其结构与机制的研究概况,并分析了NDM-1突变体的发生趋势,提示科研和医务工作者,可靠的实验室检测方法,安全的防感染控制措施以及完善的综合监测系统是我们预防或应对"超级细菌"爆发的迫切需求。

新德里金属β-内酰胺酶-1的表达、纯化与活性测试

目的 通过E.coli BL21(DE3)系统对重组质粒pET26b-NDM-1进行表达,纯化得到新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1),为新型NDM-1抑制剂的生物活性评价提供物质条件。方法 将pET26b-NDM-1重组质粒转化后,在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达;通过快速蛋白液相色谱系统,利用含氯化钠缓冲溶液对目标蛋白进行洗脱并以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel Electrophoresis, SDS-PAGE)检测纯度;利用稳态动力学研究方法,通过测定NDM-1催化头孢唑啉钠水解反应的初速率以及乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, EDTA)对该反应的半数抑制浓度(Half Maximal Inhibitory Concentration, IC50),验证并评价所制备NDM-1的生物活性。结果 SDS-PAGE及UV-Vis表征结果显示,所制备NDM-1分子量正确,纯度大于95%;稳态酶动力学活性鉴定结果表明,所得NDM-1催化活性良好,水解头孢类β-内酰胺抗生素头孢唑啉钠能力强,速率快,EDTA对该NDM-1催化底物水解反应的IC50=7.803μM。结论 表达、纯化所得金属β-内酰胺酶NDM-1具有优良的催化活性,可用以评价新型NDM-1抑制剂的抑制效果。

产新德里金属β-内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型

目的研究某三甲医院临床分离的产新德里金属β-内酰胺酶(NDM)大肠埃希菌的耐药机制和分子流行病学特征。方法在某三甲医院收集的耐碳青霉烯类大肠埃希菌中利用聚合酶链反应(PCR)筛查是否携带NDM基因,通过测序确定NDM型别并进一步检测其它碳青霉烯酶相关基因和广谱β-内酰胺酶类耐药基因。通过载体构建和表达研究NDM-1、NDM-6及NDM-9对亚胺培南的水解能力。采用多位点序列分型(MLST)对产NDM大肠埃希菌进行分子分型。结果共筛选出8株携带NDM大肠埃希菌,其中2株为NDM-9型,6株为NDM-6型。4株大肠埃希菌同时携带NDM-6、TEM和CTX-M-1基因,1株同时携带NDM-6、TEM和CTX-M-9基因。携带NDM-1、NDM-6与NDM-9重组菌对亚胺培南均耐药,最小抑菌浓度(MIC)分别为32μg/mL、128μg/mL和64μg/mL。产NDM大肠埃希菌MLST分型结果为ST226、ST648和ST1284型各1株,ST101型5株,此5株均来源于神经内科。结论首次发现同时携带NDM-6、TEM和CTX-M-1基因和携带NDM-6、TEM和CTX-M-9基因的大肠埃希菌,NDM-6、NDM-9对亚胺培南的耐药性比NDM-1强,应引起重视。MLST分型结果提示某三甲医院可能存在耐碳青霉烯类大肠埃希菌的院内局部传播。

我国北方地区部分医院产新德里金属β-内酰胺酶肠杆菌分子流行病学研究

目的调查北京、沈阳、济南、兰州等我国北方地区医院中产新德里金属β-内酰胺酶(NDM)耐药基因大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌流行情况。方法采用改良Hodge试验筛选产碳氢霉烯酶菌株;采用亚胺培南-EDTA协同试验检测金属β-内酰胺酶的产生;采用聚合酶链式反应(PCR)扩增测序筛查NDM基因;采用脉冲场凝胶电泳法(PFGE)和多位点序列分析法(MLST)对阳性菌株进行同源性分析。结果 31株大肠埃希菌和84株肺炎克雷伯菌Hodge试验阳性。其中15株大肠埃希菌和15株肺炎克雷伯菌筛选出NDM基因。MLST结果序列型(ST分型)与PFGE分型吻合。PFGE试验结果显示大肠埃希菌SY01、SY02、SY03与JN06属于同一分群,大肠埃希菌SY01、SY02、SY03图谱完全相同,且与JN06图谱同源性较高,且这4株菌ST型均为ST167。结论产NDM耐药基因的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌已出现于我国北方地区多个省会城市,且有局部散在的克隆性流行,需引起临床科室和医院感染控制部门的高度重视。

新发现的获得性金属β-内酰胺酶GIM-1和SIM-1

金属β-内酰胺酶(简称金属酶,MBL),水解底物广泛,但相对其他β-内酰胺酶是研究较少的一类酶。由于碳青霉烯类抗生素的广泛应用,使一些沉默的金属酶被激活,产酶菌株增多,一些新的金属酶基因不断被发现,尤其是由整合子介导的金属酶基因的存在使得临床治疗失败。将从新的金属酶基因的发现与传播、酶动力学参数及分子生物学特点等几方面,对新发现的获得性金属酶GIM-1和SIM-1作一综述。

金属β-内酰胺酶(IMP-1)的表达,纯化和鉴定

目的:建立金属β-内酰胺酶IMP-1的表达,纯化和鉴定方法,并探讨实验条件对分离纯化的影响。方法:pET9a/d-IMP-1质粒转化至E.coli Competent BL21(DE3)Cell并在LB培养基中表达后,通过SP Sepharose离子交换柱,得到粗提物,浓缩后用Sephadex G-75凝胶柱进一步纯化,得到IMP-1的精提物,对纯化产物用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS进行鉴定,同时用Nitrocefin作底物,测定纯化的金属β-内酰胺酶IMP-1的活性。结果:纯化的IMP-1具有较高的活性,能水解大多数抗生素。其米氏常数Km=9.28μmol/L;用MALDI-TOF-MS法测得的分子量为Mr=25111.9。结论:本文建立了金属β-内酰胺酶IMP-1的表达、纯化、鉴定方法,该法可用于其它的金属β-内酰胺酶的表达和纯化。

SMB-1型金属β-内酰胺酶的原核表达及酶活性研究

目的原核表达SMB-1型金属β-内酰胺酶,并研究其水解β-内酰胺类抗生素的活性。方法利用化学合成方法合成blaSMB-1基因,经PCR扩增后克隆至pET28a载体,构建重组的原核表达质粒pET28a-SMB-1,转化至E.coli BL21(DE3),诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA纯化后,测定其水解底物时的酶促反应动力学参数及最适pH值和温度。结果重组质粒经测序证明其正确性;表达的重组蛋白相对分子质量约为33 000,纯化后蛋白的质量浓度为0.20 mg/mL,该酶对本实验中除氨曲南外的所有β-内酰胺类抗生素均具有较高水解活性,其最适pH值为8.0,最适温度为40℃。结论利用工程菌E.coliBL21(DE3)-pET28a-SMB-1成功实现了SMB-1型金属β-内酰胺酶的原核表达,为深入研究其生物学功能及作用机制提供了物质基础,同时也为研发该酶的抑制剂提供了靶标物质。