玉米新月弯孢菌(Curvularia lunata)的RAPD分析

对分离自玉米弯孢菌叶斑病标样中的77株新月弯孢菌和1株来自水稻的新月弯孢菌进行RAPD分析表明,菌株间具有丰富的遗传多样性,在相似系数约0．60处,所有菌株被聚为3个组,但88．0％的菌株聚入第Ⅰ组内,其余菌株被聚入另外2个组内。第Ⅰ组内共有69个菌株,包含来自不同区域的致病性较强的菌株,是玉米弯孢菌叶斑病的优势类群,其余 2个类群主要是一些致病能力较弱或不致病的菌株。结果表明,新月弯孢菌种内菌株的遗传多样性与致病性相关,但与菌株地理来源无明显的直接关系。

转DsRed荧光蛋白的新月弯孢Curvularia lunata菌株构建

本研究通过农杆菌介导转化方法(ATMT),利用DsRed荧光蛋白基因对玉米弯孢叶斑病致病菌新月弯孢进行遗传转化。通过转化子的荧光蛋白基因和潮霉素B抗性基因的PCR检测,菌丝体和分生孢子的荧光观察,hyg基因的Southern杂交验证,以及荧光蛋白基因插入位点的TAIL-PCR分析,确定了DsRed荧光蛋白基因插入与表达对新月弯孢转化子的影响。结果表明:测定的4株转化子基因组中均成功整合了DsRed荧光蛋白目的基因片段;转化子在生长发育和致病性方面与野生型菌株存在一定差异,分别有2株在产孢量方面略高于野生型菌株,4株转化子在纤维素酶活性和粗毒素致病力方面均低于野生型菌株,有3株转化子在果胶酶活性上较野生型菌株有提高,1株转化子的致病力显著低于野生型菌株;获得其中3个转化子插入位点的侧翼序列。

新月弯孢霉对重楼皂苷的生物转化

目的寻找选择性水解甾体皂苷C-3位糖链末端糖基的微生物,同时制备甾体皂苷的去糖基衍生物。方法利用新月弯孢霉(3.438 1)培养,对C-3位有双糖基结构的甾体皂苷类化合物重楼皂苷Ⅴ(化合物Ⅰ)、重楼皂苷Ⅵ(化合物Ⅱ)进行生物转化;用反相C18开放柱进行转化产物的分离纯化,波谱方法鉴定其结构。结果新月弯孢霉(3.438 1)均能将化合物Ⅰ和化合物ⅡC-3位糖链末端的鼠李糖水解,转化为单糖基皂苷,转化产物分别鉴定为薯蓣皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,即延龄草苷(trillin,化合物Ⅲ)和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物Ⅳ)。结论首次发现新月弯孢霉(3.438 1)对重楼皂苷Ⅴ和重楼皂苷ⅥC-3位糖链的末端鼠李糖具有较强的水解能力。

新月弯孢不同分离物的RAPD及ITS区的PCR-RFLP分析

新月弯孢(Curvularia lunata)不同分离物之间分生孢子形态常有较大的变异,环境条件对形态的影响也较大,因此种的鉴定常常很困难,种的划分有时有随意性及模糊性.本研究利用RAPD和ITS区的PCR-RFLP技术,对形态学上应归属于C.lunata但是具有一定变异的15个分离物进行了分析.研究显示C.lunata不同分离物在遗传上具有较大的变异,C.lunata实际上是一个复合种.从树状图上看,供试分离物可以分为4组:组A(包括9个分离物),在形态学上它们具有典型C.lunata分生孢子特征,PDA培养基上不产生或者很少产生气生菌丝;组B(包括一个分离物,该菌株为新月弯孢空气变种,C.lunata var.aeria代表性菌株),它和组A的连锁距离约6.6(相似率15％),显示出它与典型C.lunata巨大的差异性,这一结果与Nakada等用基因组的RFLP分析及Tsuda等根据形态学的观察所得到的结论一致.因此,我们同意Tsu-da等将C.lunata var.aeria提升为种C.aeria的观点;组C(包括一个分离物)和其它分离物的RAPD带型相比,具有较大的差异,连锁距离达到6.7(相似率为13％,分生孢子不似典型的C.lunata分生孢子,PDA上形成大量灰色气生菌丝的菌落;组D(包括4个分离物),它们之间相似性很高,分生孢子为不呈典型的C.lunata分生孢子状,PDA培养基上,可以产生大量的灰色气生菌丝.组C和?

13种杀菌剂对草坪新月弯孢菌的毒力测定及应用分析

采用室内生长速率法测定了敌力脱、世高、适乐时、阿米西达及奥美灵系列等13种供试杀菌剂对新月弯孢菌Curuularialunata(Walker)Beodijn的抑制作用,得到13条毒力回归曲线及相应的EC50.结果表明:世高、甲基托布津、雷多米尔、奥美灵3号等4种供试药对新月弯孢菌具有极强的毒力;适乐时、敌力脱、AF 136、AF 137、阿米西达等5种供试药对新月弯孢菌的毒力作用较强;而奥美灵2号、奥美灵1号、2116、奥美灵4号等4种供试药剂,对离体条件下培养的新月弯孢菌抑制作用不明显.

玉米叶片受新月弯孢菌侵染后的细胞病理学变化

本文利用透射电子显微镜技术与细胞化学技术研究了玉米叶片受弯孢菌侵染后的超微结构和细胞壁的组成成份变化。透射电镜观察发现,病菌侵入后,菌丝先在寄主细胞间扩展,随着寄主细胞病变、坏死,菌丝可进入寄主细胞形成胞内菌丝。随病菌侵入和在寄主体内扩展,寄主细胞先后发生了一系列的超微结构变化,叶绿体、液泡等细胞器解体,出现质壁分离现象,并最终解体、坏死、变形。细胞化学标记定位发现,受侵寄主细胞壁中纤维素、木聚糖和果胶质的标记密度明显低于未接种的健康组织,表明细胞壁降解酶(如纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶)的产生与病菌侵染和致病过程密切相关。

氢化可的松高产菌株新月弯孢霉的选育

应用酮康唑抗性筛选法,将经过紫外线诱变处理的甾体11β-羟基化菌株——新月弯孢霉的原生质体倾注在含有酮康唑最小抑制浓度(10μmol/L)的再生培养基平板上,再生出136株酮康唑抗性突变株。其中氢化可的松转化率高于出发菌株的有14株,正向突变率达到10.3％,同时获得了氢化可的松转化率为出发菌株1.42倍的遗传稳定突变株KA-91。

新月弯孢菌营养体亲和群鉴定方法探讨

采用菌株直接配对、显微镜观察菌丝融合和硝酸盐缺陷型 ( nit)突变体互补测试法 ,对 44个来自不同地区的玉米弯孢菌叶斑病叶中的新月弯孢菌 ( Curvularia lunata)菌株进行了营养体亲和性分析。在野生型菌株的两两配对中 ,C.lunata菌株接触产生 4种反应类型 ,但无明显的抗衡反应产生。在菌丝融合显微观察中 ,光学显微镜下只见大多数菌丝反应为一菌丝向另一菌丝无限靠近 ,未见融合 ,但在电子显微镜下 ,发现两菌丝细胞已不再是独立的。这些结果表明 ,因两菌落间的抗衡反应和菌丝融合特征都不明显 ,故不宜采用直接配对和显微观察来划分 C. lunata的营养体亲和群。在 nit突变体互补测试中 ,菌株在 KCl O3 浓度 1 .5 %~ 3.0 %的 KPS中诱导表明 ,2 .0 %~ 3.0 % KCl O3 适宜于大多数菌株。抗氯酸盐突变体在 Czapek培养基中能鉴定出 nit突变体 ,但在 MM上却不能。全部 364 0抗氯酸盐突变体在 Czapek中共鉴定出 2 40个稳定的 nit突变体 ,其中 nit1占 5 9.2 % ,nit3占 39.2 % ,Nit M占 0 .8% ,nit D( 3种氮源都不能利用 )占 0 .8%。44个菌株中 ,2 4个 ( 5 5 % )获得了 nit突变体 ,2 0个 ( 45 % )还没有 ,仅 2个菌株 ( 1 2 4和 1 5 5 )各获得了 1个 Nit M突变体。各菌株突变体类型间只有 Nit M与 nit1或 nit3是异?

新月弯孢霉原生质体制备及再生条件的研究

以从自然界中筛选的新月弯孢菌Ｄ－１为出发菌株，进行原生质体制备及再生条件的研究。将培养至１６ｈ的Ｄ－１菌丝体经ＤＴＴ溶液处理３０ｍｉｎ后，用溶壁酶和纤维酶的混合酶液于３０℃下酶解４ｈ，原生质体释放量达到６．０×１０＾６个／ｍＬ，原生质体再生率为８．３％。

新月弯孢菌及其近似菌菌落形态和可溶性蛋白电泳图谱比较分析

通过对分离自玉米及其他寄主的 12个新月弯孢菌菌株和 5个近似菌株菌落形态及可溶性蛋白电泳谱比较分析 ,表明菌落形态在不同种之间存在明显的差异 ,同种之间也存在一定差异 ,但不稳定和存在变异。 17个菌株可溶性蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示 ,Curvularia属在Rf值为 0 177处有一条该属的特征蛋白带 ,新月弯孢菌在Rf值为 0 2 2 5处有一条该种的特征蛋白带 ,但新月弯孢菌蛋白带存在多样性 ,聚类分析将未能确定的

新月弯孢霉P450酶在甾体11β羟基化过程中的作用

目的 :考察底物 17α 羟基孕甾 4 烯 3 ,2 0 二酮 2 1 醋酸酯 (RSA)对P450酶的诱导作用 ,探讨P450酶在细胞内作用的部位 ,进而研究P450酶与新月弯孢霉转化氢化可的松能力的关系。方法 :采用CO差光谱法对新月弯孢霉P450酶含量进行检测 ,分别在转化过程的不同时期加入不同浓度的RSA ,检测P450酶含量和氢化可的松产量。分别考察RSA在菌体细胞悬液和去菌体细胞上清液中的转化情况。结论 :RSA对P450酶具有诱导作用 ,在对数期初期 (12h)加入 0 5g/L的RSA对P450酶的诱导作用最佳 ,对细胞的生长抑制作用较小。P450酶是胞内酶。氢化可的松转化过程中 ,在对数生长期 ,P450酶含量平稳升高 ,进入产氢化可的松时期后 ,经过一段迟滞期 ,P450酶含量迅速增高。

稗草生防菌新月弯孢菌株J15(2)的生物学特性

研究了分离自稗草上的一个致病菌新月弯孢Curvularia lunata菌株J15（2）的基本生物学特性。结果表明，该菌菌丝生长、产孢的最适温度为28～32℃，pH为6～8。菌丝生长对光照无要求，黑暗利于增加产孢量，培养至15d可达产孢高峰。碳、氮、磷和硫等元素是该菌菌丝体生长、产孢的必需元素，钾、镁和铁对菌丝体的生长、产孢有极大的促进作用。分生孢子萌发的适宜温度范围为20～35℃，最适温度28℃；适宜培养基初始pH值在4～10之间。在58℃下，分生孢子10min失活。

用新月弯孢霉11β-羟基化16α-甲基化合物RS-21醋酸酯

对新月弯孢霉AS3.4381的菌丝体转化16α-甲基Reichstein's化合物S21-醋酸酯(Ⅰ)生成16α-甲基氢化可的松(Ⅱ)进行了研究。培养24h的菌丝体的11β-羟基化活性最高;乙醇对此羟基化活性的抑制作用明显。当(Ⅰ)浓度为0.15%,转化72h,产物(Ⅱ)的重量收率为55.4%。

玉米致病菌新月弯孢漆酶基因家族鉴定与分子结构特征分析

漆酶在真菌的孢子分裂、子实体分化、黑色素生成、木质素降解酶和病菌致病中均起重要作用。采用生物信息学的方法,在玉米致病菌新月弯孢基因组基础上对漆酶基因家族成员进行了鉴定和序列特征分析,结果表明玉米致病菌新月弯孢共有8个漆酶基因,分布在6个不同的scaffolds上,其漆酶基因结构显示外显子和内含子大小与位置都不一样,表现出复杂的基因结构。序列比对和系统发育分析发现,8个漆酶氨基酸序列与其他真菌来源漆酶一样具有4个特征保守序列区,位于系统发育树的2个不同分支上,表明玉米致病菌新月弯孢漆酶可能与其他真菌的漆酶具有相似的进化关系和功能。

新月弯孢霉原生质体的形成与11β-羟基化反应

研究了新月弯孢霉原生质体形成的条件以及 1 1 β-羟基化反应。将培养 1 6～ 1 8h的菌体 ,以0 .6mol/LKCl作为渗透压稳定剂 ,3 0℃下 ,经过 1 %溶壁酶和 1 %纤维素酶混合酶液 ( pH5.6)酶解 4～ 5h ,原生质体释放量达 6.1 1× 1 0 6/ml,再生率为 1 3 .1 %。原生质体细胞具有 1 1 β -羟基化反应的能力 ,氢化可的松转化率为 4 4.4 4%。

新月弯孢子座的结构和形成条件

新月弯孢 [Curvularialunata (Walk)Boed ]是近些年我国北方玉米主栽区新发生的弯孢菌叶斑病的致病菌 ,它以分生孢子进行重复侵染。在试验中 ,当用高粱培养基进行扩繁培养时 ,新月弯孢能产生一种无性繁殖体 子座。

马唐草新月弯孢生物学特性及其代谢产物活性测定

对马唐草新月弯孢霉Curvularia lunata(Wakker)Boedijn菌株MT-011的生物学特性测定结果表明:该菌株致病性强,菌丝体生长最适温度30℃,致死温度65℃/10min,最适pH值7,碳源以D-果糖最佳,氮源以硝酸钠最佳。产生分生孢子最适温度为30℃,最适pH值9,碳源以蔗糖产孢量最大,氮源以赖氨酸产孢量最高。分生孢子萌发温度在20～40℃之间没有差异,萌发率均达90%以上;最适pH值7;光暗交替为最佳光照条件。除赖氨酸外所有供试碳源和氮源的孢子萌发率都很高,处理之间没有差异。MT-011菌株产生的活性物质作用于马唐草,可使叶片黄化或枯死脱落,与用菌体接种时造成大量叶片黄化或枯萎的症状极为相似。代谢产物对指示植物柱花草、辣椒和玉米的种子发芽后的根茎生长都有明显的抑制作用,抑制率达83.27%,表现出很好除草活性。

蓖麻籽水提物对玉米新月弯孢菌的毒力测定

采用生长速率法测定了蓖麻籽水提物对玉米新月弯孢菌的生物活性。结果表明,该提取物对玉米新月弯孢菌有明显的抑制活性,其中第24、48和96 h的EC50分别为2.9、4.2和5.6mg/ml。

玉米新月弯孢菌产毒素条件的研究

研究了玉米新月弯孢菌产毒的部分培养条件,以期为新月弯孢菌毒素的大量制备提供高效、统一的方法。采用PDA、改良Fries两种液体培养基,以静止、间歇震荡和连续震荡三种培养方式及接种培养10、15、20天为产毒条件,研究不同因素对玉米新月弯孢菌产毒能力的影响,并分析了毒素对种子萌芽期的萌芽抑制率、胚根生长抑制率及芽长抑制率的影响。改良的Fries培养基产毒能力较强;连续震荡培养有利于弯孢菌产生更多的毒素;新月弯孢菌产毒的最佳时间为15天。将提取的粗毒素稀释50、100、200倍处理玉米种子,萌芽率和根长长度与对照相比均差异极显著,而芽长长度均差异不显著。

提高新月弯孢霉原生质体再生率的研究

报道了氢化可的松生产菌新月弯孢霉的原生质体制备与再生条件。将培养 2 2h的菌丝体用0 .3mol L的二硫苏糖醇处理 2 0min ,0 .6mol L的KCl作为渗稳剂 ,30℃下经 0 .5 %新生酶 2 34和 1%溶壁酶混合液(pH5 .6 )酶解 3.5h ,原生质体释放量达到最大值 8.15× 10 6 个 ml,再生率为 2 3.0 7%。再生菌株菌落形态不变 ,保留了对底物RSA的羟化能力。