血清型特异性水泡性口炎病毒同步检测和鉴别方法的建立

为准确地鉴别诊断新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)和印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IND),本研究建立了可以同时检测和鉴别诊断VSV-NJ和VSV-IND的双重荧光RT-PCR方法,并对方法性能进行了测试和初步应用。结果显示,建立的双重荧光RT-PCR特异性为100%,最低检测限1~10个拷贝/μL,扩增效率E值均在99%左右,R2值分别为0.999和0.998。VSV-NJ和VSV-IND单荧光RT-PCR与双重荧光RT-PCR的相关性系数分别为0.9997和0.9994,与单荧光RT-PCR相比,该引物和探针的双重体系混合对特异性和敏感性均未产生明显干扰。用已知VSV-NJ及VSV-IND阳性核酸验证,发现符合率为100%,对50份临床样品的检测均为阴性,与单荧光RT-PCR结果一致。本研究建立的双重荧光RT-PCR方法实现了VSV-NJ和VSV-IND的同步检测和鉴别,为水泡性口炎的防控提供了技术储备。

表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建

埃博拉病毒(EBO V)能够引起一种人畜共患急性出血性传染病,即埃博拉出血热。研制安全、有效的抗病毒疫苗具有重要意义。本研究利用水泡性口炎病毒(V SV)印第安纳株反向遗传操作系统,构建并拯救得到表达扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBO V)囊膜糖蛋白G P的重组V SV(rV SV-ZEBO V-G P),通过w estern blot和免疫荧光试验证明在重组病毒中ZEBO V G P蛋白获得正确表达;动物试验显示重组病毒对小鼠高度安全;中和试验结果表明重组病毒能诱导小鼠产生针对ZEBO V囊膜糖蛋白G P嵌合V SV假病毒粒的特异性中和抗体。本研究表明rV SV-ZEBO V-G P作为防控ZEBO V的储备性疫苗具有潜在的应用价值。

莱斯顿型埃博拉病毒GP蛋白嵌合型水泡性口炎病毒的构建与免疫原性研究

莱斯顿型埃博拉病毒(REBOV)可以感染猪和非人类灵长类动物并引起动物发病和死亡,为制备安全、有效的REBOV重组病毒后备疫苗,本研究利用表达绿色荧光蛋白的水泡性口炎病毒(r VSV-EGFP)印第安纳弱毒疫苗株反向遗传操作系统,拯救出了REBOV GP蛋白嵌合型VSV(r VSV△G*GFP-REBOV-GP),并对其生物学特性进行分析,评估其作为REBOV活疫苗的安全性和有效性。激光共聚焦和western blot试验显示REBOV GP蛋白在嵌合病毒中获得正确表达;病毒生长动力学结果显示,r VSV△G*GFP-REBOV-GP与亲本株具有不同的生长特性;将r VSV△G*GFP-REBOV-GP接种小鼠,未引起小鼠发病,体重增长趋势与对照组一致,表明嵌合病毒具有良好的安全性;中和试验结果表明该嵌合病毒能够诱导小鼠产生针对REBOV GP的高滴度中和抗体。本研究制备的r VSV△G*GFP-REBOV-GP为进一步的动物免疫实验奠定了基础。

猪水疱病和水疱型口炎的诊治

1猪水泡病猪水泡病是由水泡病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。该病只发生于猪,不感染牛、马、羊。其主要特征是猪蹄、鼻、口腔、乳房及皮肤出现水疱和烂斑,与猪口蹄疫的临症表现很相似。该病流行无明显的季节性,不同品种、年龄的猪均可感染发病,传染快,发病率高,可达70%~80%,但病死率很低。（1）病原分析。病原体是肠道病毒属的猪水泡病病毒,与人的肠道病毒柯萨奇B5有抗原关系。

印第安纳型水泡性口炎病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

利用ESE-Quant tube scanner监测平台,建立了一种基于实时荧光RT-LAMP技术的印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)快速检测方法。根据VSV-IN的G基因序列,设计6条特异性引物,在63℃条件下,进行核酸扩增,反应时间为45 min。在扩增前加入SYBRGreenⅠ染料作为反应的指示剂,以SYBRGreenⅠ染料的荧光强度作为结果判定标准。结果表明,建立的实时荧光RT-LAMP方法操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性好,能快速检测VSV-IN,并可以区分新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)。

TaqMan~T-PCR对水疱性口炎病毒的鉴定检测

水疱性口炎分为印第安那型 ( Indiana)和新泽西型 ( New Jersey)。这两种血清型病毒的快速和可靠的鉴别对该病的诊断、检疫、分子流行病学调查和监测至关重要。文章按照 VSV核蛋白基因序列 ,设计了一对两型通用引物和两型各自特异性探针。研究建立了 VSV实时荧光定量 PCR检测方法 ,对 VSV细胞培养物、人工感染实验动物组织、血清样品 ,以及系列稀释的不同 TCID50 样品、其它相关或相似病毒进行鉴定 ,同时与常规 PCR、病毒分离试验作了比较。Taq Man○R RT-PCR的特异性和敏感性相当于或优于对照方法。重复性和稳定性试验证实 ,该方法可靠。每个试验中设立阳性、阴性对照和标准稀释度对照 ,使试验结果可对病毒 RNA作准确定量 ,并可在 4h内获得结果。研究结果表明 ,Taq Man○R RT-PCR方法是一种特异性强、敏感性高、快速安全的定量检测方法。因此 ,可以作为 VSV的快速检测和定型。

聚古罗糖醛酸硫酸酯通过增强Ⅰ型干扰素表达抑制水疱型口炎病毒

目的对从海洋褐藻中提取的低分子量硫酸化多糖聚古罗糖醛酸硫酸酯(PGS)进行抗病毒活性评价。方法通过流式细胞仪分析、蛋白质印迹法(Western blot)和定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)评估PGS对水泡疱性口炎病毒(VSV)的抗病毒活性。结果PGS具有抗VSV的活性。初步研究机制表明,PGS可能通过增强Ⅰ型干扰素(IFN)表达发挥抗病毒作用。

HIV-1假病毒的构建及对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系的感染研究

目的:分离、克隆水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-GP)编码基因,包装人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)假病毒,并研究其对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1细胞的感染状况。方法:根据GenBank登记的VSV-GP基因核苷酸序列设计1对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pHCMV-G为模板,PCR扩增VSV-GP基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pVSV-GP。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的HIV-1基因组重组质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染人胚肾HEK293T细胞,收获细胞进行Western blot,检测HIV-1p24蛋白的表达;收获HIV-1假病毒感染BCBL-1细胞,进行虫荧光素酶(Luciferase)报告基因活性检测以及用ELISA的方法检测感染后细胞上清中HIV-1p24蛋白的含量。结果:PCR分离、克隆的VSV-GP序列全长1536bp,序列经过核酸分析证实;Western blot在HIV-1p24蛋白预期位置检测到特异性条带;HIV-1假病毒感染BCBL-1细胞后上清可以检测到HIV-1p24蛋白,并且测得Luciferase活性值较对照组显著增高(P<0.05)。结论:成功包装了HIV-1假病毒,并且该病毒可以感染BCBL-1细胞。

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测水泡性口炎病毒方法的建立

本研究旨在建立一种快速、灵敏的用于诊断水泡性口炎的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)和新泽西型水泡性口炎病毒(VSVNJ)的G基因,然后将其连接到克隆载体pMD19-T上,构建质粒标准品pMD-VSV-IN-G和pMD-VSV-NJG。根据GenBank中VSV-IN和VSV-NJ的G基因保守序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ法进行实时荧光定量RT-PCR,建立标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果,在拷贝数6.82~6.82×10^(8)copies/μL范围内,C;值与质粒拷贝数的对数值呈良好的线性关系,pMD-VSV-IN-G标准曲线的R;值为0.99812,p MD-VSV-NJ-G标准曲线的R^(2)值为0.99748;检测其他病毒均无特异性扩增曲线,特异性良好。pMD-VSVIN-G的检测灵敏度为6.82 copies/μL,pMD-VSV-NJ-G的检测灵敏度也为6.82 copies/μL,是普通RTPCR方法的10倍。用该方法对实验室保存的VSV-IN和VSV-NJ各5份攻毒小鼠样品进行检测,检测结果与普通RT-PCR检测一致。上述结果表明,本检测方法的建立对快速、灵敏鉴别诊断IN型和NJ型水泡性口炎病毒具有重要的应用价值。

表达马尔堡病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建

为了构建携带e GFP标签并表达马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)囊膜糖蛋白(GP)的复制型水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis v,iVrSuVs)假型病毒,通过将VSV感染性克隆全长质粒中的G基因替换成马尔堡病毒的GP基因,与4个辅助质粒p3.1-VSV-N、p3.1-VSV-P、p3.1-VSV-L、p3.1-VSV-G共转染BSR细胞,拯救成功的重组VSV病毒传5代后,进行Western-blot、间接免疫荧光试验、RT-PCR鉴定和生长动力学曲线检测。显微镜检测结果显示,3个重组全长质粒分别与4个辅助质粒共转染BSR细胞培养48 h后均能使细胞发生合胞体病变并伴有绿色荧光蛋白表达;Western-blot、间接免疫荧光试验鉴定结果显示,3株马尔堡病毒的囊膜糖蛋白在重组VSV病毒中正确表达;生长动力学曲线显示,3株重组VSV病毒的毒力相较于母本VSV病毒均降低,但病毒滴度依旧能达到1×10^(6)~1×10^(7)TCID_(50)mL^(-1)。结论:本研究成功构建3株携带e GFP标签表达MARV GP的复制型VSV假型病毒,为后续MARV疫苗与抗体的效果评价等奠定了基础。

多重荧光RT-PCR同步检测及鉴别诊断口蹄疫和水泡性口炎

本研究建立了可以同时检测和鉴别通用型口蹄疫病毒(FMDV)、新泽西型水泡性口炎病毒(VSVNJ)和印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IND)的多重荧光RT-PCR方法,并进行了验证和应用。结果显示,建立的多重和单一荧光RT-PCR扩增效率E值约100%,R2>0.999,扩增效果良好,最低检测限可达到约10 copies/μL,方法特异性为100%。FMDV、VSV-NJ和VSV-IND单一荧光RT-PCR与多重荧光RT-PCR之间的相关性系数分别为0.9995、0.9998和0.9994,与单一荧光RT-PCR相比,多重混合对特异性和敏感性均未产生明显干扰。用已知的FMDV和VSV-NJ及VSV-IND阳性核酸19份验证,符合率为100%。经国家口蹄疫参考实验室分别对62份阳性、50份阴性FMDV样品进行验证,结果一致。从100份临床样品中筛查到10份FMDV阳性,未见混合感染,与单一荧光RT-PCR结果相符。本研究建立的多重荧光RT-PCR方法实现了一次检测同时鉴别多重病毒的目的,适用于混合感染水泡性疫病的临床快速筛查。

5种人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的初步建立

为建立可同时检测裂谷热病毒(RVFV)、戊型肝炎病毒(HEV)、狂犬病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)及口蹄疫病毒(FMDV)5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR快速检测方法,本研究根据GenBank登录的上述5种病毒的全基因组序列,设计了5对多重PCR引物,通过优化反应条件,建立检测以上5种病毒的多重RT-PCR方法。通过对同一种属的其他病毒及相关病毒的检测,确定方法的特异性;通过对体外转录合成的RNA进行定量检测的方法,确定方法的敏感度。实验结果表明:在同一RT-PCR反应体系中可同时检测以上5种病毒,扩增片段长度分别为499bp、137bp、274bp、224bp、389bp;而对新城疫病毒(NDV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛流行热病毒(BEFV)和乙型脑炎病毒(JBEV)的检测均为阴性;5种病毒RNA的最低检测拷贝数分别为2.91×104、3.14×103、1.25×103、6.65×103和2.38×104。利用该方法对11份RV已知阳性样本和7份HEV已知阳性样本检测结果均呈阳性。本研究建立了一种快速、可同时检测5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR检测方法,该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。