改良法分离培养SD新生乳鼠原代心肌细胞

目的:建立一种稳定、快速的SD新生乳鼠原代心肌细胞分离培养改良方法。方法:取SD新生乳鼠心室,0.12%Ⅱ型胶原酶消化,Percoll密度梯度离心结合5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)化学抑制法纯化心肌细胞,体外培养于含5%马血清的改良DMEM/F12中,次日更换为普通含10%胎牛血清的高糖DMEM继续培养,并比较此改良方法与传统差速贴壁法的差异。结果:改良法获得的心肌细胞生长良好,接种24 h后几乎全部贴壁生长,细胞呈三角形、梭形或不规则形,个别细胞出现自主搏动,频率为10~30 beats/min不等。48 h后心肌细胞变长伸出伪足,部分细胞呈现同步搏动,频率接近50~80 beats/min。72 h后心肌细胞成菊花样交织成网,自发搏动趋于同步,频率加快至80~100 beats/min;96 h后细胞聚集成簇,呈岛屿样,同步搏动频率在100~120 beats/min左右,一周内细胞状态良好。改良法纯化原代心肌细胞的得率((1.17±0.15)×10^(6) vs(1.21±0.22)×10^(6),P>0.05)和存活率与传统差速贴壁法相当(93.3%±1.4%vs 92.2%±0.7%,P>0.05),但是改良方法获得的原代心肌细胞纯度更高(94.7%±2.1%vs 89.5%±1.3%,P<0.05),且用时较短((3.1±0.4)h vs(4.3±0.3)h,P<0.01)。结论:改良法获得心肌细胞耗时短、纯度高、结构功能保存完整,且实验重复和稳定性好,是一种理想且简单易行的的原代心肌细胞分离培养方法。

柯萨奇B_(3m)病毒感染新生乳鼠致急性病毒性心肌炎模型的研究

目的 探讨制备柯萨奇B3m病毒感染Balb/C新生乳鼠急性病毒性心肌炎模型的实验途径。方法 对柯萨奇B3m亲心肌株病毒进行增毒 ,滴定TCID5 0后感染Balb/C新生乳鼠。CVB3m病毒感染组 3窝共 2 1只 ,对照组 3窝共 2 0只。感染组每只乳鼠腹腔内接种 10 0 0TCID5 0CVB3m病毒液 0 0 4ml,对照组每只乳鼠腹腔内接种 16 40维持液 0 0 4ml。观察感染乳鼠的发病及心肌病理变化。结果 感染组乳鼠在感染CVB3m后 48～ 72h发病 ,心肌病理变化以多形核细胞、单核细胞和巨噬细胞浸润为主要特征 ,心肌小血管壁内皮细胞受损 ,心肌细胞变性、肿胀 ;对照组乳鼠未见发病。结论 柯萨奇B3m病毒是急性心肌炎的重要病原体 ,其毒力及接种量与发病密切相关 。

新生乳鼠胸腺的超微结构研究

本文研究新生乳鼠胸腺形态学特点,结果表明:1.胸腺小叶尚未完好形成,皮、髓质分界不甚清晰;2.髓质常可见由上皮细胞构成的囊性结构;3.内皮质有少数淋巴细胞胞浆含有糖原颗粒;4.胸腺小体少而小。本文描述了胸腺淋巴细胞、上皮性网状细胞、巨噬细胞、指突细胞等细胞成分和血胸屏障等结构的超微结构特征。

大蒜素对新生乳鼠肠道细菌移位的影响

目的考察大蒜素对新生乳鼠肠道细菌移位的作用。方法乳鼠140只随机分为10组:0,1,7,14,28 d空白对照组和0,1,7,14,28 d大蒜素组,每组14只。空白对照组腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.03 mL/g,1次/d;大蒜素组腹腔注射大蒜素注射液0.005 mg/g,1次/d。0 d组在出生后即处死,其余各组均在各时间点末次给药后20 min处死乳鼠并收集指标。结果与对照组比较,大蒜素连续28 d后,新生乳鼠体重显著增加(P<0.05),G+球菌和G-杆菌的浓度显著降低(P<0.05),乳酸杆菌的浓度无显著影响(P>0.05),肠系膜淋巴结、肝和脾的细菌浓度显著降低(P<0.05),细菌检出的阳性器官数也略低。结论大蒜素有助于建立新生乳鼠肠道细菌平衡。

杂色曲霉素对新生乳鼠致癌作用的实验研究

我们采用单次杂色曲霉素灌喂新生乳鼠，以观察其诱发肺癌的作用。

新生乳鼠脑瘫模型制作及评价

小儿脑性瘫痪是目前小儿时期最主要的运动功能伤残疾病，且终生存在。细胞移植和基因治疗技术的飞速发展为治疗此类疾病带来了希望。建立一种稳定的脑瘫动物模型，将上述技术应用于实验研究是问题的关键。我们应用一侧颈总动脉结合缺氧的方法制作乳鼠脑瘫模型，不同时间观察其行为学、神经电生理及脑组织病理变化，探讨和总结乳鼠缺血缺血模型的制作和评价方法。

新生乳鼠大脑神经胶质细胞对人巨细胞病毒易患性研究

目的探讨人巨细胞病毒（HCMV）体外感染新生Balb／c乳鼠原代培养大脑神经胶质细胞的特征及其敏感性。方法建立了新生乳鼠大脑皮质细胞原代培养方法并进行病毒感染。在感染后的不同时间，分别在光镜下连续观察摄影记录，并取样42份，进行抗HCMV单抗的免疫组化染色和地高辛标记的HCMV寡核苷酸探针检测病毒核酸及其胞内定位分布的原位杂交试验。同时，同样取正常对照组培养片36份进行试验。结果HCMV能感染新生乳鼠大脑皮质细胞，受感染的神经胶质细胞，在感染后第4天即可观察到细胞病变，表现为细胞肿胀变圆。测定感染细胞上清中病毒半数组织培养感染量，表明病毒在细胞内复制。免疫组化和原位杂交结果均证实，HCMV感染后48小时，即可分别在受感染细胞内检出病毒早期抗原和病毒核酸；且上述阳性结果的出现均比在同期受感染的神经细胞早，易观察。结论新生乳鼠大脑皮质神经胶质细胞较神经细胞对HCMV更为易感染，表明前者在HCMV致中枢神经系统感染的建立及病理的发生发展中具有重要作用。

单克隆抗体对肾综合征出血热病毒感染乳鼠保护作用的研究

HFRS病毒陈株100LD_(50)腹腔感染新生乳鼠后24小时,腹腔分别接种24株抗HFRS病毒McAb,观察McAb对感染新生乳鼠的保护作用。结果发现,有5株McAb保护率为100％,1株McAb保护率为17％,另有7株McAb可使感染乳鼠的发病死亡时间推迟。取有明显保护作用的5株McAb分别接种感染后不同时间的乳鼠,结果在48小时内接种保护率均达100％;但随接种时间推后,保护率逐渐下降,感染后10天接种几乎无保护作用。此5株McAb保护作用均优于多克隆的免疫血清。应用不同稀释的McAb 3D8进行保护试验,发现保护效果与接种剂量密切相关。采用固定抗体,稀释病毒方法测得McAb 3D8对HFRS病毒陈株感染乳鼠的保护指数为5.8。

体外培养的乳鼠皮层神经元氧糖剥夺后轴突损伤的实验观察

目的：建立乳鼠皮层神经元体外培养模型，观察氧糖剥夺处理对神经元轴突损伤的影响。方法取出生24 h 内的 SD 大鼠大脑皮层神经元，采用逐渐降低培养液中血清浓度和添加阿糖胞苷的方法培养、纯化神经元，观察其形态并鉴定。建立氧糖剥夺模型，随机分为正常对照组和氧糖剥夺处理组（2、4、6、8 h 各1组）。采用噻唑蓝比色法测定神经元活性，βⅢ-tubulin 免疫荧光染色观察轴突形态学变化。结果神经元培养3～5 d 后，胞体变得饱满并分出轴突和树突，突起之间逐渐交织成密集网络，神经元微管相关蛋白-2（MAP-2）标记阳性率＞95％。与正常对照组相比，随着氧糖剥夺时间的延长，轴突网络逐渐损伤、崩解，同时神经元活性呈梯度下降（P ＜0.01）。结论该研究成功建立了神经元体外原代培养及氧糖剥夺模型，并观察到在氧糖剥夺处理过程中神经元的轴突损伤及同时出现的神经元活性下降。

乳鼠窦房结细胞原代培养与纯化方法的探讨

目的:探讨乳鼠窦房结细胞的原代培养与纯化方法,观察细胞的生长状况,分析窦房结细胞的自律性及形态结构特征。方法:取SD乳鼠96只随机分为试验组和对照组,每组各48只,每次试验各取6只乳鼠窦房结组织,分别用前述两种方法进行细胞培养观察和比较两个培养组中各种细胞的数量及生长状况,以细胞的搏动频率评价细胞的活性,以梭形细胞的数量评价窦房结细胞的纯度。结果:(1)试验组明显减少了酶与细胞的接触时间和离心时间;简化了操作环节,优化了细胞的培养环境,可提高细胞的活性;(2)经过差速贴壁、阿糖胞苷处理,可明显减少不规则细胞的数量,窦房结细胞的数量明显上升(P<0.01)。结论:试验组纯化培养法是一种较为可行的乳鼠窦房结细胞原代培养方法,可为进一步研究提供高纯度、高活力的窦房结细胞。

延迟5分钟剖宫产造全脑缺氧缺血新生大鼠模型

目的建立围产期全脑缺氧缺血性损伤的新生大鼠模型。方法 SD雌性大鼠妊娠21 d时,颈椎脱臼法处死,用止血钳夹闭双侧子宫角血管5 min后,剖宫产取出新生大鼠,交由代乳鼠喂养。结果造模组雌性大鼠9只,共娩出新生大鼠91只,出生3 d内死亡7只,死亡率7.7%。新生大鼠出生第2天进行翻身实验,第14天进行悬吊实验和斜坡实验,造模组和其余各组均有显著性差异。新生大鼠出生后21 d,取脑组织切片行HE染色,显示大脑皮层典型的缺氧缺血性损伤,与正常组相比,可见神经细胞明显的病理形态学改变。结论采用延迟5min剖宫产和代乳鼠喂养的方法,操作简便,并结合行为学测试筛选行为异常者,可建立稳定可靠、可供长期实验使用的围产期全脑缺氧缺血性损伤的新生大鼠模型。

不同来源乳铁蛋白对幼鼠肠道发育的影响

目的探究哺乳期乳铁蛋白(lactoferrin,LF)的缺失及不同来源LF补充后对幼鼠肠道发育的影响。方法以LF基因敲除型雌鼠作为哺乳母鼠造成幼鼠哺乳期无LF的摄入,且从幼鼠出生第3~21天每日人工饲喂100 mg/kg牛血清白蛋白(BSA)、牛源乳铁蛋白(bovine Lactoferrin,bLF)及重组人源乳铁蛋白(recombinant human Lactoferrin,rhLF),于幼鼠21日龄取样,测定各组小鼠小肠发育指标。结果在本实验周期下,哺乳期rhLF的补充显著性增加小鼠回肠绒毛长度/隐窝深度值(P<0.05),且上调回肠Occludin和ZO-1基因的表达(P<0.05),增加小鼠十二指肠、空肠和回肠麦芽糖酶酶活/乳糖酶酶活比值(P<0.05),表明哺乳期rhLF的补充能够增强小鼠肠道消化吸收能力和肠屏障功能;哺乳期bLF的补充显著增加小鼠十二指肠及回肠麦芽糖酶活性/乳糖酶活性比值(P<0.05)。结论对于哺乳期无LF摄入的乳鼠来说,哺乳期间LF的补充能够增强乳鼠肠道对营养物质的消化吸收能力、促进肠道的发育成熟、增强肠道屏障功能,并且,本实验中rhLF表现出比bLF更加有效的作用。

^(3)HTdR诱导乳鼠肺肝混合培养细胞的恶性转化及其染色体分析

对新生乳鼠肺、肝来源的原代混合培养细胞,在每ml培养液中加入0.1μci的^(3)HTdR进行诱导。受^(3)HTdR作用组细胞能长期存活,接种于免疫抑制动物形成纤维肉瘤,证明发生了恶性转化。对恶性转化细胞进行染色体分析,见有长臂染色体、中着丝点染色体等稳定型畸变,以及染色体断片、单体断裂等非稳定型畸变,说明3HTdR对DNA的损伤,是导致细胞染色体畸变,进而发生恶性转化的重要原因。非稳定性畸变在多次传代的转化细胞中仍然存在,说明微量^(3)HTdR可能残留于DNA中,持续对细胞造成损伤。

黄芪丹参1∶1配伍对缺氧缺血性脑损伤乳鼠脑组织神经细胞凋亡的影响

目的通过研究黄芪丹参1∶1配伍对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)乳鼠脑组织Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表达的影响,探讨其对脑组织的保护作用及机制。方法选择生后7 d SD乳鼠77只,随机分为假手术组(28只)、模型组(28只)及中药组(21只),应用免疫组化法观察不同时间点各组乳鼠脑组织Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白的表达情况。结果模型组在造模后各时间点Caspase-3及Bax的含量均显著高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05),模型组在造模2 h后Bcl-2含量显著高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05),在造模1 d、3 d后Bcl-2含量有升高趋势,但差异无统计学意义,造模7 d后,Bcl-2含量有下降趋势;中药组在造模后各时间点Caspase-3、Bax含量均较模型组显著降低,Bcl-2含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论黄芪丹参1∶1配伍能有效上调HIBD乳鼠脑组织Bcl-2蛋白表达,下调Caspase-3及Bax蛋白表达,从而抑制神经细胞凋亡,减轻缺氧缺血所致的脑组织损伤。

心脏再生的研究进展

冠心病及心肌梗死的发生率正呈逐年上升趋势,成人心肌细胞有限的再生能力限制了心肌梗死后心脏功能的恢复。斑马鱼及新生乳鼠心脏再生能力的发现给该领域带来了新的方向及希望。心脏再生动物模型种类日渐丰富,不同的生物模型对于不同的研究目的有着重要的作用。本文总结了近年来心脏再生动物模型的发展,并对心脏再生机制探索中所取得的重要研究进展进行论述。

TNF-α在乳鼠心肌细胞中诱导HSP70蛋白表达的研究

热休克蛋白70(HSP70)在细胞修复、存活和维持细胞正常功能方面有着重要作用。作为分子伴侣,它起着心肌保护的作用。已经对重症心脏病人的心肌组织进行了蛋白组学研究,得到了HSP70在心衰病人心肌组织中较正常人心肌组织表达升高的结论,并且在血液中得到了进一步的验证。在进一步的离体细胞实验中用不同剂量的肿瘤坏死因子-alpha(TNF-α)刺激乳鼠心肌细胞,以观察不同时间点HSP70的动态表达情况。培养乳鼠心肌细胞,分别对细胞进行热休克(42℃)、TNF-α和缺血缺氧处理,在不同的时间点收获细胞,以观察HSP70的动态表达情况。用免疫化学、ELISA以及Western blotting的方法对HSP70蛋白进行分析。结果表明,在正常对照细胞中基本没有阳性信号出现,而在经缺血缺氧、热休克(42℃)以及TNF-α处理的细胞中有明显的阳性表达。以上研究首次在乳鼠心肌细胞中证明TNF-α诱导的HSP70表达具有时间和浓度依赖性。通过运用TNF-α对HSP70蛋白表达影响的研究,初步推断HSP70的表达模式,为体内诱导产生HSP70从而发挥心肌保护作用的研究提供一定的理论基础。

产毒性大肠杆菌菌毛(F_(41))单克隆抗体体内被动传递保护作用的研究

产毒性大肠杆菌(ETEC)F_(41)^+菌株20 LD_(50)喂饲感染BALB/c新生乳鼠,在感染前、后3h,给母鼠尾静脉注射1∶10或1∶100稀释的抗F_(41)单克隆抗体(McAb),观察McAb对感染新生乳鼠的传递被动保护作用。结果发现,感染前McAb 1∶10的保护率为100％,1∶100的保护率为11.5％;感染后McAb 1∶10的保护率为51.7％,1∶100的保护率为4.1％。这表明传递被动保护作用是有效果的,保护效果与McAb的注射剂量和注射时间密切相关。

孕期吸烟对SD大鼠胚胎心脏发育的影响

目的探讨孕期吸烟对SD大鼠胚胎心脏发育的影响及分子机制。方法将24只怀孕SD母鼠随机分为4组:正常对照组、10支烟/d组、20支烟/d组、40支烟/d组,每组6只,并于孕期0.5 d(GD 0.5)后开始给予吸烟处理直至分娩。采用超声多普勒Vevo2000检测出生后1 d的新生乳鼠的左心结构及其心脏功能;采用Color-Doppler检测心室血流方向,以确认室间隔的发育是否异常。心功能检测完毕后,收集各组新生乳鼠心脏组织,采用Western-blot检测心肌特异转录因子GATA4的表达量。结果各组新生乳鼠心脏重量无明显差异,40支烟/d处理组乳鼠体重显著下降,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。孕期持续给予40支烟/d被动吸烟处理能显著降低左心室重量、左心室舒张/收缩末期前壁厚度和左心室舒张/收缩末期后壁厚度,差异均有统计学意义(P<0.05)。孕期给予20支烟/d和40支烟/d处理后,新生乳鼠的GATA4蛋白表达呈剂量依赖性下调,40支烟/d组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论母鼠在怀孕期间接受被动吸烟后,引发后代新生乳鼠的心功能受损,其机制可能与下调心肌特异转录因子GATA4表达相关。

柯萨奇病毒A16型灭活疫苗保护效果研究

目的:研究柯萨奇病毒A 16型候选疫苗株(CA 16-KM)经灭活后免疫小鼠,对病毒攻击的保护效果。方法:用Vero细胞进行CA 16-KM株培养,病毒收获后经浓缩、蔗糖密度梯度离心进行纯化及β-丙内酯灭活,用酶联免疫吸附法(ELISA法)对灭活后的CA 16-KM病毒液进行抗原含量的测定并在Vero细胞上盲传3代对灭活后CA 16-KM毒株的残余毒力进行检测。灭活后的病毒加入氢氧化铝佐剂(质量浓度为1 mg·mL^(-1)),经离心及PBS重悬,制成实验性灭活疫苗。分别于第0天和第14天经肌肉注射免疫8周龄ICR母鼠,对照组用等体积PBS代替。分娩后24 h内的新生乳鼠用100 LD_(50)的CA 16强毒株(CA16-CC)经颅内注射进行攻毒,攻毒后连续21 d观察其临床症状,研究该灭活疫苗对新生乳鼠的保护效果。结果:经β-丙内酯灭活后的CA 16-KM在Vero细胞上盲传3代均无细胞病变效应(CPE)出现,灭活后的CA 16-KM抗原含量为320 EU·mL^(-1)。经注射实验性疫苗的乳鼠攻毒后全部存活,表明CA 16-KM株制备的灭活疫苗诱导的免疫反应可对新生乳鼠产生100%的保护作用。结论:β-丙内酯对CA 16-KM毒株的灭活效果较好;CA 16-KM疫苗候选株灭活后具有良好的免疫原性,可以保护新生乳鼠抵抗CA 16病毒的攻击,也许是研制CA 16灭活疫苗的理想毒株。