新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利,本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞。结果,利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22 h内贴壁并发生细胞分裂,6~7 d明显增殖,10~12 d汇合成单层,连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征。倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11~12代细胞发生变形,间隙增大。细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性。电镜下,纹状缘整齐,紧密连接结构清晰可见。结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞。

新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利，本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞。结果，利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株．获得的上皮细胞具有较强的增殖能力，22小时内贴壁并发生细胞分裂，6～7天明显增殖，10~12天汇合成单层，连续传代培养至12代，细胞基本失去上皮样特征。

新生犊牛小肠黏膜结构的早期发育及上皮内淋巴细胞和杯状细胞的数量变化

应用组织学和组织化学方法研究了1日龄和20日龄新生犊牛小肠黏膜结构的早期发育及部分黏膜免疫相关细胞的分布与数量变化规律。结果显示，从1日龄到20日龄，小肠绒毛变短，尤其十二指肠的绒毛长度约缩短了61．58％（P〈0．05），绒毛长度与隐窝深度比值（V／C比值）减小了59．04％～91．32％（P〈0．05）；而黏膜和肌层厚度分别增加了8．66％～41．28％和36．22％～299．10％。小肠各段上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量随年龄增长而逐渐增多（P〈0．05），20日龄比1日龄分别增加了78．80％～163．05％和28．23％～101．46％；但比较同一年龄的小肠不同肠段，从十二指肠至回肠，上皮内淋巴细胞的数量逐渐减少，而杯状细胞的数量则呈增多趋势。

仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定

【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18(ETEC F18)引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1的CDS区第307位点处的突变(G→A),建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系(GG、GA和AA)。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上皮细胞分离效率对比表明,后一种消化方式更为有效。进而取出生12 h内未吃初乳的大白仔猪,剖腹剪取其小肠段,使用联酶混合液灌注消化分离得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。电镜和CK18免疫荧光染色结果均显示,小肠黏膜上皮细胞纯度达90%以上。经纯化处理,最后获得了FUT1基因型为GG和GA的两种小肠黏膜上皮细胞。仔猪原代小肠黏膜上皮细胞培养周期显示,7代前细胞生长状况良好,形态为典型的上皮细胞样,单层细胞呈铺路石排列,培养至第9代,细胞出现生长停滞、胞体空泡化等现象。【结论】最终获得了FUT1基因型为GG和GA的仔猪原代小肠黏膜上皮细胞。建立了仔猪小肠黏膜上皮细胞分离及培养方法,为后续的细胞建系工作奠定了良好的基础。

猪源乳酸杆菌对致病性沙门菌、大肠埃希菌黏附仔猪小肠上皮细胞的影响

为了通过仔猪小肠上皮细胞(ZYM-SIEC-02)体外培养模型,观察猪源乳酸杆菌对细胞的黏附作用,以及对致病性沙门菌、大肠埃希菌黏附细胞的竞争、排斥和置换作用。采用乳酸杆菌在体外与ZYM-SIEC-02共同孵育镜下观察其黏附效果;乳酸杆菌与致病性沙门菌、大肠埃希菌共同黏附ZYM-SIEC-02观察其黏附竞争性;用乳酸杆菌预处理ZYM-SIEC-02后再加入致病性沙门菌、大肠埃希菌孵育观察其黏附排斥性;用致病性沙门菌、大肠埃希菌预处理ZYM-SIEC-02后再加入乳酸杆菌孵育观察其黏附置换性。结果表明:乳酸杆菌可以黏附ZYM-SIEC-02,具有剂量效应。乳酸杆菌与致病性沙门菌或大肠埃希菌同时加入细胞一起培养时,能竞争性的黏附细胞且黏附抑制率也具有剂量效应。乳酸杆菌预处理细胞后再加入致病菌,高含量乳酸杆菌(1010 mL-1)能使致病菌的黏附率下降。但是,用致病菌预处理细胞后再加入乳酸杆菌,只有高含量的乳酸杆菌可以置换致病菌,而低含量乳酸杆菌却能增加致病菌对细胞的黏附。研究结果为乳酸菌作为微生态制剂用于临床上防治仔猪沙门菌病、大肠埃希菌病,减少食物源性污染和提高食品安全提供试验依据和理论基础。

仔猪小肠上皮细胞的体外培养及猪流行性腹泻病毒对其感染性研究

本研究旨在建立一种操作简单的仔猪小肠上皮细胞体外培养体系,为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的相关研究提供材料。研究以未吃初乳的新生仔猪作为肠道供体,采用肠腔面刮取肠黏膜和机械分离分散的方式进行原代细胞的体外分离。采用0.1%胰蛋白酶差速消化法进行仔猪小肠上皮细胞的纯化;比较新生弱仔猪和正常仔猪作为供体对原代小肠上皮细胞活性的影响;MTT法比较不同代次原代细胞的增殖活性;免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR方法检测PEDV毒株CV777在原代小肠上皮细胞感染和增殖情况。结果显示,本研究建立的体外分离培养方法能获得增殖活性良好的原代小肠上皮细胞,具有明显的“S”型细胞增殖曲线。通过胰酶差速消化可得到纯度高、形态单一的小肠上皮细胞,同时细胞连续传代5次仍保持良好的增殖活性。弱仔猪和正常仔猪分离培养的小肠上皮细胞的增殖活性比较显示,两者并没有明显区别,这为降低原代细胞培养的成本提供新的思路。免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR结果显示,PEDV可感染本方法分离培养的仔猪原代小肠上皮细胞,并在其中进行复制增殖。本研究建立了一种操作简单、实用性强、成本较低的仔猪原代小肠上皮细胞体外培养方法,该方法培养的原代细胞可作为PEDV分离培养和相关研究的基础材料。

猪源乳酸杆菌抑制金黄色葡萄球菌黏附仔猪小肠上皮细胞的影响

为了分析猪源乳酸杆菌对仔猪小肠上皮细胞(ZYM-SIEC-02)的黏附作用以及p H值为4、5、6、7、8、9不同酸性介质下的生长情况,比较竞争、排斥和置换3种不同作用方式下猪源乳酸杆菌对金黄色葡萄球菌黏附仔猪小肠上皮细胞的抑制作用。结果表明:乳酸杆菌黏附仔猪小肠上皮细胞具有浓度效应,在适宜的范围内,随着乳酸杆菌浓度增加,黏附仔猪小肠上皮细胞的作用增强;108CFU/m L菌液黏附能力为(20.02±0.63)CFU/个,其效果较好。不同p H缓冲介质条件下乳酸杆菌黏附仔猪小肠上皮细胞的能力不同,但酸性环境有利于乳酸杆菌黏附仔猪小肠上皮细胞;p H值为4和5时,仔猪小肠上皮细胞黏附乳酸杆菌数量较多,分别为(55.3±0.96)和(59.9±1.26)CFU/个。乳酸杆菌对金黄色葡萄球菌黏附仔猪小肠上皮细胞均具有明显抑制作用,其中排斥作用方式的抑制能力最强(108CFU/m L乳酸杆菌),置换作用方式的抑制能力最弱(106CFU/m L乳酸杆菌)。本研究可为乳酸杆菌作为微生态制剂在兽医临床中的使用提供依据。

新生仔猪口腔黏膜上皮细胞的体外培养方法

为了建立仔猪口腔黏膜上皮细胞（oral mucosal epithelial cells，OMEC）的体外培养方法，取新生仔猪的口腔颊膜组织，分别采用组织块培养法、胰蛋白酶消化法、DispaseⅡ和胰蛋白酶联合消化培养法、DispaseⅡ处理联合组织块培养法，对口腔黏膜上皮细胞进行原代和传代培养，用倒置显微镜观察培养细胞形态学特征及生长情况，对传代培养的OMEC，采用间接免疫荧光法检测广谱细胞角蛋白的表达情况，并进行透射电镜观察，用MTT法测定细胞的生长曲线，流式细胞仪检测其细胞周期。结果表明，在采用相同培养基条件下，采用组织块培养法、胰蛋白酶消化法不能成功培养仔猪OMEC，用DispaseⅡ和胰蛋白酶联合消化法培养的细胞不易贴壁，培养困难，采用DispaseⅡ处理联合组织块培养法培养的细胞增殖能力强，细胞纯度高，可连续传到10～11代，经鉴定具有OMEC特征。本试验成功建立了仔猪口腔黏膜上皮细胞的原代及传代培养方法，为进一步研究OMEC的永生化及猪口蹄疫致病机理和疫苗提供理想实验材料。

丙氨酰-谷氨酰胺二肽对仔猪小肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin定位与表达的影响

本试验以分离自仔猪空肠上皮的IPEC-1细胞为模型,探讨丙氨酰-谷氨酰胺二肽(Ala-Gln)对仔猪小肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin定位与表达的影响。试验选取同代IPEC-1细胞接种至6块6孔细胞培养板上,分别用含0(对照组)、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L Ala-Gln的DM EM高糖培养基进行培养,待细胞生长融合达70%以上时,对occludin进行免疫荧光定位和蛋白质印迹(Western Blot)检测。结果表明:1)对照组细胞可见其胞质内存在团状的阳性荧光染色,而细胞间连接处阳性荧光染色不明显;随着Ala-Gln浓度的升高,细胞间连接处荧光信号逐渐增强,细胞轮廓更加清晰,而胞质内荧光信号逐渐减弱。2)各添加组IPEC-1细胞间occludin的相对表达量均极显著高于对照组(P<0.01)。随着Ala-Gln浓度的升高,occludin的相对表达量呈先增后减的趋势,添加量为2.00 mmol/L时达到峰值,且极显著高于其他添加量(P<0.01)。由此可知,Ala-Gln可以上调仔猪小肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin的表达,促进细胞间紧密连接结构的形成,进而增强仔猪小肠黏膜的屏障功能。

用荧光抗体技术和肠细胞粘附试验检测K88^+E.coli对仔猪小肠上皮的粘附作用

细菌粘附到宿主粘膜表面是细菌致病的前提,在引起人、畜腹泻的大肠杆菌中已经发现了许多具有粘附作用的蛋白质抗原,例如 K88、K99、987P、F41、CFA/I、CFA/Ⅱ等抗原。这些抗原也叫菌毛或粘附素,它们位于菌体表面,能特异粘附到宿主小肠上皮细胞上,使细菌克服肠道蠕动的排斥在小肠内定居、繁殖。目前已经用遗传工程技术克隆3菌毛基因,用菌毛蛋白制成的疫苗,预防大肠杆菌腹泻,效果很好。在我国,新生仔猪大肠杆菌腹泻的发病率很高,仔猪腹泻大肠杆菌多数具有K88抗原,本实验建立了荧光抗体染色和肠细胞粘附二种方法,检测了K88+E.coli的粘附能力和菌毛的生物活性。

α-卡茄碱对仔猪小肠上皮细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响

为研究α-卡茄碱对仔猪小肠上皮细胞生长情况及生长状态的影响,试验用不同水平的α-卡茄碱(0μg/mL,A组;0.4μg/mL,B组;0.8μg/mL,C组)对培养的仔猪小肠上皮细胞进行刺激,并采用体外细胞培养及MTT比色法进行相关指标的测定。结果表明:α-卡茄碱作用于仔猪小肠上皮细胞24、48、72 h后,B组、C组细胞增殖率与A组相比有所降低,分别降低3.67%、14.78%,8.63%、20.81%,19.39%、28.18%,且差异显著(P<0.05)。G0/G1期,24、48、72 h时,随着α-卡茄碱添加水平的增加而逐渐增加,B组、C组与A组相比分别增加19.84%、38.30%,19.17%、52.39%,32.17%、56.14%,差异显著(P<0.05)。S期逐渐降低,B组、C组与A组相比差异显著(P<0.05),24 h降低10.61%、29.84%;48 h降低14.95%、32.51%;72 h降低25.13%、40.27%。G2/M期逐渐下降,B组、C组与A组相比24 h时分别下降8.66%、12.44%,差异不显著(P>0.05);48 h时分别下降15.73%、69.13%,差异显著(P<0.05);72 h时分别下降34.40%、86.27%,差异显著(P<0.05)。α-卡茄碱作用细胞24、48、72 h后,B组、C组凋亡率与A组相比差异显著(P<0.05),分别增加220.50%、505.50%,121.93%、218.31%,69.12%、382.54%。综上,α-卡茄碱降低了细胞的增殖率;随着α-卡茄碱添加水平和处理时间的逐渐增加,细胞的凋亡率也逐渐增加。

不同浓度α-卡茄碱对仔猪小肠黏膜上皮细胞增殖率的影响

[目的]研究α-卡茄碱对仔猪小肠黏膜上皮细胞增殖率的影响。[方法]以体外培养的仔猪小肠黏膜上皮细胞系IPEC-J2为试验材料,向其中添加不同浓度的α-卡茄碱,分别于培养的24、48、72 h采集细胞样品,采用MTT法测定细胞的增殖率。[结果]浓度为0.1、0.2μg/mL的α-卡茄碱处理24 h后,其细胞增殖率较对照组相比差异不显著(P>0.05);而0.4、0.8、1.6μg/mL组的增殖率与对照组相比,极显著(P<0.01)降低。处理48 h后,0.1μg/mL组增殖率与对照组相比差异不显著(P>0.05);而0.2、0.4、0.8、1.6μg/mL组与对照组相比,极显著(P<0.01)降低。处理72 h后,各处理组增殖率与对照组相比,极显著(P<0.01)降低。[结论]α-卡茄碱可以降低仔猪小肠黏膜上皮细胞增殖率,其浓度越高对小肠黏膜上皮细胞增殖率的影响越明显(P<0.01),作用时间越长细胞增殖率降低越明显(P<0.01)。

等孢球虫病是新生仔猪腹泻的一大难题

新生仔猪球虫病是由猪等孢球虫和某些艾美耳属球虫寄生于肠上皮细胞引起的原虫性疾病,以发生腹泻为主要临床特征,呈世界性分布,约占仔猪腹泻性疾病中的15%～20%,美国每年导致的经济损失就高达1亿美元以上。它不仅会导致新生仔猪腹泻、消瘦、脱水等，还出现断奶、成活率下降、增重缓慢、饲料转化率降低、延长断奶时间、整齐度差等，给养猪生产带来严重的经济损失。

刺五加苷E对脂多糖介导的仔猪小肠上皮细胞屏障功能基因表达的影响

通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导仔猪小肠组织上皮细胞(IPEC-J2)建立损伤模型,探讨刺五加苷E(Eleutheroside E,EE)对IPEC-J2屏障功能的保护作用。采用单因素试验方法,分为对照组C组(等量的完全培养基),E组(完全培养基+0.1 g/L EE),L组(完全培养基+10 mg/L LPS),EL组(完全培养基添加0.1 g/L EE预处理6 h后再添加10 mg/L的LPS进行培养),采用RTCA及q-PCR方法对IPEC-J2细胞的增殖活性、炎症因子以及紧密连接蛋白mRNA表达量变化进行检测。EE对LPS介导的IPEC-J2的增殖活性试验结果显示:与C组相比,EE对IPEC-J2细胞增殖活性显著提高,LPS对IPEC-J2细胞有显著的抑制作用(P<0.05),且EL组IPEC-J2增殖活性与L组相比明显提高(P<0.05)。EE对LPS介导的IPEC-J2的免疫细胞因子影响的结果显示:与对照组相比,EE显著降低了炎性细胞因子IL-6、TNF-α、INF-γ的mRNA相对表达量(P<0.01),抗炎性细胞因子IL-10、TGF-β显著升高(P<0.01);L组的炎性细胞因子mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),抗炎性细胞因子mRNA相对表达量显著降低(P<0.01)。EE预处理组相比于LPS损伤组,IL-6、TNF-α、INF-γmRNA相对表达量显著降低(P<0.01),IL-10 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),TGF-β的mRNA相对表达量上调,但差异不显著(P>0.05)。EE对LPS介导的IPEC-J2细胞紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响试验结果显示:与C组比,E组Occludin(P<0.05)、ZO-1和Claudin-3(P<0.01)的mRNA相对表达量显著升高,LPS显著下调Occludin、Claudin-3和ZO-1的mRNA相对表达量(P<0.01)。与LPS损伤组相比,EE预处理组显著上调了Occludin(P<0.05)、Claudin-3和ZO-1(P<0.01)的mRNA相对表达量。结果表明:添加EE能够缓解LPS诱导的IPEC-J2细胞增殖活性的降低,改变细胞因子和紧密连接蛋白的基因表达,进而起到保护肠道机械屏障和免疫屏障功能的作用。

新生仔猪腹泻病因分析与防控建议

一尧病因新生仔猪的肠道是无菌的,但是很快会受到细菌的侵袭。在初乳以及稍晚于初乳期的母乳中发现的抗体可以保护仔猪免于这些细菌的损害。不摄入初乳的仔猪和由未接种疫苗的母猪所产下的仔猪患病几率较大。第一批在新生仔猪身体上繁殖的细菌之一是大肠杆菌,导致新生仔猪腹泻的大肠杆菌菌株通过菌毛(毛状凸起),最常见的是K99或F5菌毛,粘附在小肠细胞上,并分泌毒素(通常为热稳定毒素,ST),导致氯离子流失,体液渗出随后腹泻。

当前国内外仔猪等孢球虫病的流行现状

猪等孢球虫病是由猪等孢球虫寄生于猪小肠上皮细胞而引起的一种寄生性原虫病，呈全球性分布，主要危害集约化猪场7～15日龄仔猪群，以腹泻（排淡黄色浆糊状稀粪）、脱水、体重下降和死亡为主要临床特征。在临床上易与仔猪黄白痢和轮状病毒、梭菌及肠炎等引起的仔猪腹泻混淆，常造成误诊，延误了治疗时机，影响仔猪群整齐度、断奶体重、断奶成活率、饲料成本、断奶时问等指标，

仔猪等孢球虫与等孢球虫病研究进展

仔猪等孢球虫病是由猪等孢球虫寄生在哺乳期及新近断奶仔猪小肠上皮细胞所引起的一种寄生性原虫病,呈世界性分布,给养猪场造成严重的经济损失。本文对猪等孢球虫病的病原分类、虫体形态和生活史、致病性、流行病学特点、临床症状、病理变化、诊断、防治等方面的目前研究状况进行了综述,为猪等孢球虫病的有效防制提供参考。

要重视球虫病引起的仔猪腹泻

猪球虫病是由猪等孢球虫寄生于猪小肠上皮细胞而引起的一种原虫病，呈全球性分布，主要危害猪场7-14日龄仔猪，以非出血性腹泻（排淡黄色浆糊状稀粪）、衰弱、脱水、体重下降、生长迟缓和时有死亡为主要特征，故又称“10日龄腹泻”。抗生素治疗无效，在临床上易与仔猪黄白痢和轮状病毒等引起的仔猪腹泻混淆，常造成误诊，延误了治疗时机，影响仔猪群整齐度、断奶体重、断奶成活率、断奶时间、经济效益等指标，给养猪生产造成严重的经济损失。

浅析仔猪球虫病的危害和防治

猪球虫病是由猪等孢子球虫寄生于哺乳期及断奶前后仔猪小肠上皮细胞引起仔猪腹泻的原虫病。由于此病与黄痢和白痢有相似之处，不易区别，极易造成误诊。在实际的猪场管理中，许多猪场管理者对球虫病重视也不够，由此造成了很多的损失，下面笔者就自己对该病的认识谈谈个人的想法。1 发病情况球虫病以7~14日龄仔猪腹泻为主要临床症状，排黄色或黄白色黏糊状粪便，带有气泡，黏肛，1~2d后变为排有酸乳臭味的水样稀便。