新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养与鉴定

【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细胞经免疫组化法和碱性磷酸酶染色法鉴定呈阳性;透射电镜观察显示,细胞表面有微绒毛和桥粒连接。用流式细胞仪检测的结果显示,第4代新生山羊RTECs中G1期和S期细胞分别占细胞总数的25.01%和74.99%,G2/G1为1.97%,第10代细胞中G1期细胞和S期细胞均占50.00%,G2/G1为1.88%;第4代细胞的早期凋亡率在0.32%左右,而第10代可达3.7%,远高于第4代细胞。【结论】建立了增殖快、细胞活力高的山羊RTECs分离培养方法。

缺血再灌注损伤对新生鼠肾小管上皮细胞细丝蛋白的影响

目的 通过研究缺血再灌注不同时段细丝蛋白在肾小管上皮细胞中的分布变化 ,探讨细丝蛋白在肾脏缺血再灌注损伤中所起的作用。方法 建立新生大鼠不同时段的肾脏缺血再灌注模型 ,通过免疫荧光法检测细丝蛋白在肾小管上皮细胞上的分布及其表达量。结果 细丝蛋白在正常时主要分布在肾小管上皮细胞基底部附近 ,缺血 0 .5 h时其分布变化不明显 ,再灌注 0 .5 h后 ,细丝蛋白开始向胞浆转移 ,并出现在细胞顶部和肾小管腔内 ,再灌注 2 h这种改变最明显并伴肾小管结构的破坏 ;从再灌注 2 4h起开始进入恢复阶段 ,细丝蛋白逐渐重新回到基底部 ,再灌注 12 0 h后恢复阶段基本结束 ,肾小管结构正常。结论 细丝蛋白在缺血再灌注时分布发生改变 。

整合素β_1在新生猪肾小管上皮细胞缺氧损伤中的变化

目的 探讨新生儿窒息所致肾脏损害机制。方法 运用抗霉素 ( antimycin) A无糖血清的培养基 ,建立 3 0、60、90和 12 0 min肾小管上皮 ( RTE)细胞缺氧模型 ,检测 RTE细胞中三磷酸腺苷 ( ATP)含量 ,采用流式细胞技术测定 RTE细胞整合素β1 数量的变化。结果 成功建立了 3 0、60、90、12 0 min低 ATP管上皮细胞模型。各时段( 3 0、60、90和 12 0 m in)组 ATP含量较正常组明显降低 ( P<0 .0 0 1)。随缺氧时间的延长 ,整合素 β1 水平有逐渐下降趋势 ,3 0、60、90和 12 0 min组较正常组明显降低 ( P均 <0 .0 0 1) ,各组间比较 ,P均 <0 .0 0 1。结论 整合素β1 在缺氧新生猪 RTE细胞的减少 。

缺血再灌注损伤对新生鼠肾小管上皮细胞F-actin的影响

目的 研究缺血再灌注不同时段纤维型肌动蛋白(F-actin)在肾小管上皮细胞中分布变化情况,探讨F-actin在肾脏缺血再灌注损伤中所起的作用。方法 建立新生大鼠不同时段的肾脏缺血再灌注模型,通过免疫荧光法检测F-actin在肾小管上皮细胞上的分布,并计算各组F-actin的表达量。结果 正常时,F-actin主要聚集在上皮细胞基底膜处;缺血0.5 h后,细胞浆内的F-actin开始增加;再灌注0.5 h后,大量F-actin开始向胞浆内转移,基底部的表达减少;再灌注2 h后,F-actin在胞浆中仍很多,但在基底部的表达开始增加。结论 缺血再灌注损伤时F-actin的分布从基底部移行到胞浆内,可能由此导致整合素和Na+-K+-ATP酶分布的去极化,引起上皮细胞的脱落和对钠离子重吸收的障碍。

Na^+/H^+交换器-1在新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞损伤中的作用

目的探讨Na+/H+交换器-1(NHE1)在新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)损伤中的作用。方法以HK-2为研究对象,以200 mL/L新生儿窒息后血清作为攻击因素处理HK-2细胞。首先将实验分为2组:对照组和窒息组,通过免疫组织化学方法检测其HK-2细胞在损伤前后胞内NHE1的表达;再分为3组:对照组、窒息组和5-N-乙基-N-异丙基-阿米洛利(EIPA)干预组(每组8个复孔)。倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HK-2细胞活力,生物化学法检测细胞培养液中LDH漏出率变化。结果与对照组比较,窒息组细胞内和细胞膜上NHE1表达明显增加;与对照组比较,窒息组细胞形态发生改变;窒息组细胞的活细胞数量较对照组明显降低;LDH漏出率明显升高,差异具有显著性意义(Pa=0);与窒息组细胞比较,EIPA干预组细胞形态明显得到改善,活细胞数量明显增加,LDH漏出率降低,差异具有显著性意义(Pa=0)。结论新生儿窒息后血清诱导HK-2细胞NHE1的表达增强可能是导致HK-2损伤的重要机制之一,通过抑制NHE1活性可使细胞损伤减轻,活性增强。

促红细胞生成素减轻窒息新生儿血清诱导人肾小管细胞损伤

目的研究促红细胞生成素(EPO)对新生儿窒息后血清导致人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的保护作用。方法以HK-2为研究对象,分为对照、窒息和EPO干预组(每组n=8),以200mL/L窒息血清作为攻击因素,观察各组细胞形态、LDH漏出率和细胞存活[四甲基偶氮唑蓝(MTT)法]变化。结果与对照组比较,窒息组细胞形态发生改变,LDH漏出率增加,细胞存活减少,差异有显著性(P<0.05);而与窒息组比较,除EPO1IU/mL组外,EPO组细胞形态明显得到改善,LDH漏出率降低,细胞存活增加,差异具有显著性(P<0.05),且具有剂量依赖性。结论EPO有减轻窒息后血清所致HK-2细胞损伤作用。

黄芪注射液对新生儿窒息后血清诱导人肾小管细胞损伤信号机制的影响

目的从细胞蛋白水平和分子水平研究黄芪对新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞(HK-2细胞株)损伤的信号传导机制的影响〔是否通过激活核因子κB(NF-κB)信号途径〕。方法以HK-2细胞株为研究对象,以20%窒息血清作为攻击因素,攻击前分为空白对照组和黄芪预处理组,在攻击后15min,1、2 h分为相应时间的血清攻击组和黄芪预处理组后攻击组。通过激光共聚焦显微镜观察间接免疫荧光染色后NF-κB核转位以及免疫印迹(Western blot)观测NF-κB抑制亚基I-κBα量的变化。结果攻击前与空白对照组比较,黄芪预处理组NF-κB核转位和I-κBα量无改变;而攻击后各组与空白组对照组比较,NF-κB核转位显著增加和I-κBα量显著减少,以攻击后1 h最明显;各时点黄芪预处理组后攻击组与空白攻击组比较,NF-κB核转位显著减少和I-κBα量显著增加。结论黄芪预处理能够抑制窒息后血清所致后续NF-κB激活。

新生儿窒息后血清诱导人肾小管细胞粘附中性粒细胞的作用及机制

目的研究新生儿窒息后血清诱导的人肾小管细胞粘附中性粒细胞的作用及机制。方法以HK-2细胞株为研究对象,用含20%的窒息后血清作为诱导因素。实验分空白对照组、窒息组(窒息后1,3,7d组)和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干预组。分别检测各组细胞悬液中髓过氧化物酶(MPO)活性;检测HK-2细胞膜ICAM-1和细胞核内NF-κB的表达。结果窒息后1d血清组细胞悬液MPO值显著高于各PDTC干预组、对照组及窒息后3,7d血清组(P<0.01)。窒息后1d血清组HK-2细胞表面ICAM-1表达和HK-2细胞核NF-κB表达亦显著高于各PDTC干预组、对照组及窒息后3,7d血清组(P<0.01)。结论窒息后血清可以诱导肾小管上皮细胞活化进而粘附中性粒细胞,其作用机制可能涉及到窒息后血清活化了NF-κB,从而使肾小管上皮细胞膜表面ICAM-1表达增加,进而粘附中性粒细胞。

核糖霉素对新生儿肾功能影响的观察

庆大霉素能致新生儿肾毒作用,已有作者进行了研究。核糖霉素同属庆大霉素类之抗生素,它是否影响新生儿肾功?本文就27例因新生儿感染而住院应用了核糖霉素的患儿,行血β2—MG蛋白及尿N—2酰—β—D—氨基葡萄糖苷酶（简称NAG酶）检测,以观察用药前及用药后变化,判断有否新生儿肾功能损害。现报道如下。 1 对象及方法 1.1 对象:以1991年10月至1992年1月因感染住院新生儿为观察对象。

发动相关蛋白在窒息新生儿血清诱导人近曲肾小管上皮细胞损伤中的作用及重组人促红细胞生成素干预的影响

目的探讨发动相关蛋白1(Drp-1)在新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤中的作用及重组人促红细胞生成素(rhEPO)干预的影响。方法将培养的HK-2细胞分为对照组、窒息组和rhEPO干预组,以新生儿重度窒息(Apgar评分<4分)后24 h血清(20%体积比)作为攻击因素。光镜下观察其线粒体形态变化,活细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力,免疫组织化学检测其Drp-1表达,投射电子显微镜下观察其线粒体的形态变化。结果 1.HK-2细胞形态学变化:对照组及rhEPO干预组细胞生长良好,窒息组细胞发生凋亡相关改变。2.细胞活力变化:与对照组细胞活力(0.74±0.08)相比,窒息组细胞活力(0.41±0.06)明显降低,rhEPO干预组细胞活力(0.60±0.08)较窒息组好转,但未恢复至对照组水平(P<0.05)。3.免疫组织化学法测定Drp-1表达:与对照组(0.24±0.03)相比,窒息组细胞Drp-1表达(0.51±0.03)显著升高,rhEPO干预组(0.38±0.03)较窒息组降低,但未恢复至对照组水平(P<0.05)。4.线粒体形态变化:对照组和rhEPO干预组线粒体结构完整,可见线粒体嵴;窒息组线粒体嵴消失,膜肿胀,空泡变性。结论 rhEPO可减轻新生儿窒息后血清诱导的HK-2细胞凋亡,其机制可能是通过减少Drp-1的表达抑制线粒体的分裂而实现。

二氮嗪对新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞损伤的保护作用

目的探讨二氮嗪对窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的保护作用。方法以HK-2为研究对象,以200 mL/L新生儿窒息后血清作为攻击因素处理HK-2细胞。将HK-2细胞分为对照组、窒息组、二氮嗪组。对照组加入100 mL/L胎牛血清培养液;窒息组加入等量200 mL/L新生儿窒息后血清培养液;二氮嗪组将二氮嗪加入等量200 mL/L新生儿窒息后血清培养液,使终浓度为100μmol/L。倒置相差显微镜下观察HK-2细胞的形态学改变并照相,四甲基偶氮唑蓝比色法检测HK-2细胞活力,生物化学法检测细胞培养液LDH漏出率。结果对照组细胞贴壁良好,呈铺路石样,为扁平的多角形,分裂相多,细胞排列紧密,连接成片,数量多。与对照组相比,窒息组细胞受损明显,形态改变,由典型的扁平多角形细胞变为不规则圆形或椭圆形,细胞间空隙加大,连接松散,细胞间可见较多细胞碎片;细胞活力下降,LDH漏出率增加(P<0.05)。与窒息组相比,二氮嗪组细胞损伤状况明显得到改善,细胞生长状况明显好转,形态明显变好;细胞活力增加,LDH漏出率降低(P<0.05),但未恢复至对照组水平。结论二氮嗪具有减轻窒息后血清诱导的HK-2损伤的作用。

促红细胞生成素对新生儿窒息后血清诱导人肾小管上皮细胞损伤信号传导的影响

目的探讨促红细胞生成素(EPO)对新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的信号传导机制的影响。方法选择足月重度窒息新生儿50例。男28例,女22例;均未使用免疫抑制剂,无明显感染性疾病,且取得家属知情同意。在窒息后1 d抽取其外周静脉血5 mL,2 500 r/min离心10 min分离血清,56℃水浴30 min灭活补体,微孔滤器过滤除菌,采用DMEM/F12培养液配制成200 mL/L的攻击浓度。以HK-2作为攻击对象。攻击前分为空白对照组和EPO预处理组(5×104IU/LEPO的培养基预处理24 h),在攻击后15 min、1 h、2 h分为相应时点的攻击组和EPO预处理后攻击组。通过激光共聚焦显微镜观察间接免疫荧光染色后核因子-κB(NF-κB)核转位。Western blot法检测NF-κB抑制亚基I-κBα水平的变化,将Western blot结果扫描进入计算机,应用Image-Pro Plus图像分析软件对条带进行分析,以条带积分吸光度值代表蛋白表达量。结果攻击前,与空白对照组比较,EPO预处理组NF-κB核转位显著增加,I-κBα显著减少(Pa<0.05);攻击后,各组与空白对照组比较,NF-κB核转位显著增加,I-κBα显著减少(Pa<0.05),以攻击后1 h最明显;各时点EPO预处理后攻击组与血清攻击组比较,NF-κB核转位显著减少,I-κBα显著增加(P<0.05)。结论EPO预处理通过预激活NF-κB而抑制窒息血清,导致后续NF-κB进一步激活。

AT_2受体诱导新生大鼠肾小管上皮细胞凋亡的研究

目的 探讨AT_2受体在诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用。方法 通过取新生大鼠肾小管上皮细胞体外培养,传代后加入不同浓度AT_2受体兴奋剂CGP-42112A,在不同时间用流式细胞仪测定凋亡细胞比值,并结合TUNEL分析。结果CGP-42112A不同浓度加入细胞24h后,随着剂量的增大,凋亡细胞所占比值逐渐增加,与对照组比较均具有显著差异,P<0.001。10^(-5)M CGP-42112A作用于细胞,随着时间的延长,凋亡细胞所占比值逐渐增加,与对照组比较有显著差异,P<0.001。结论 AT_2受体可诱导新生大鼠肾小管上皮细胞凋亡,凋亡细胞数与受体剂量正相关,与受体兴奋剂作用时间正相关。