新生猪胰岛移植治疗糖尿病病人的临床研究(英文)

目的:评估新生猪胰岛移植治疗1型糖尿病方法的安全性和有效性。方法:所有22例病人均接受经肝动脉新生猪胰岛移植治疗,移植后病人接受多种免疫抑制治疗方案;第1组14例病人使用环孢菌素、骁息和甲基强的松龙,没有接受猪C肽检测;第2组2例病人只使用环孢菌素和骁息,第3组6例病人的免疫抑制方案是OKT3、他克莫司、西罗莫司和甲基强的松龙。在移植治疗前和移植后1年,病人进行了血糖、外源性胰岛素用量、糖化血红蛋白、猪内源性反转录病毒(PERV)和肝功能的评估,第2组和第3组的8例病人接受了血清猪C肽检测。6例病人在移植后4～6年进行了复查。结果:第1组14例病人移植后胰岛素用量减少和HbA1c水平降低。第2组2例病人在移植后代谢指标没有变化,猪C肽检测阴性。第3组的6例病人在移植3个月以后,胰岛素用量均减少,HbA1c正常,6例病人血清均检测到有意义的猪C肽。其中2例病人接受了第2次新生猪胰岛移植,1例病人短暂脱离胰岛素治疗7 d。所有病人在移植后均未出现严重不良反应,没有PERV感染的证据。6例病人在新生猪胰岛移植4～6年后接受检查,此6例病人均在接受移植治疗1年后停止免疫抑制治疗,复查时6例病人均接受胰岛素治疗。其中4例病人严格限制糖的摄入,2例病人为自由饮食;这2例病人中,有1例出现2次酮症,有轻度糖尿病视网膜病变;1例出现1次由于急性胃肠炎导致的酮症;其余4例均未出现任何并发症。6例病人再次接受PERV检测均为阴性。结论:异种胰岛可以在人体内存活并发挥其功能,没有发现严重不良反应。

AAV体外介导hCTLA4-Ig在新生猪胰岛细胞中的表达与生物学活性

目的:探讨AAV-hCTLA4-Ig体外感染猪胰岛细胞后,hCTLA4-Ig基因的表达能力及生物学活性。方法:腺相关病毒载体(AAV)介导hCTLA4-Ig体外转染新生猪胰岛细胞(NIPs),用RT-PCR和免疫细胞化学法检测胰岛细胞内hCTLA4-Ig mRNA及蛋白质水平的表达。转染后的新生猪胰岛细胞与人淋巴细胞共孵育,通过ELISA法检测培养基中IL-2,IFN-γ,TNF-α细胞因子水平的变化。并观察转染组与对照组葡萄糖刺激后的胰岛素释放反应。结果:转染组NIPs可检测到hCTLA4-Ig基因及蛋白表达;与人淋巴细胞共孵育后IL-2,TNF-α,IFN-γ浓度明显低于对照组(P<0.01);且葡萄糖刺激胰岛素释放反应与对照组无明显差异(P>0.05)。结论:AAV-CTLA4-Ig体外转染的胰岛细胞能够表达具有生物学活性的hCTLA4-Ig,可抑制T细胞激活,而胰岛细胞生理功能不受影响。

小分子RNA干扰组织因子在新生猪胰岛细胞中的表达

目的:利用小分子RNA(siRNA)在基因水平对新生猪胰岛细胞进行修饰,抑制细胞组织因子的表达。方法:设计5对siRNA转染新生猪胰岛细胞,用real-time PCR方法筛选组织因子基因沉默效果最好的siRNA或组合,同时流式细胞仪检测siRNA转染对细胞活性的影响,real-time PCR和流式细胞仪分别检测细胞组织因子的基因及蛋白沉默水平。结果:根据real-time PCR结果筛选出组织因子基因沉默效果最好的3对siRNA组合,转染新生猪胰岛细胞后,real-time PCR及流式细胞仪检测新生猪胰岛细胞组织因子的基因沉默效率达60%,蛋白表达水平降低约50%,同时流式细胞仪检测结果提示siRNA转染对新生猪胰岛细胞的活性没有明显的影响。结论:3对siRNA组合在体外特异性抑制新生猪胰岛细胞组织因子的表达。

新生猪胰岛细胞团的体外培养体系

目的分离纯化新生猪胰岛细胞团(NPCCs),以不同的体外培养方式促进NPCCs成熟,筛选最佳方案。方法利用供龄分别为3天的新生猪,参考Bonner-Weir法和Hill法分离纯化NPCCs,分别以培养体系Ⅰ(90%DMEM、10%胎牛血清、双抗、2 mmol/L谷氨酰胺+0.01%大豆胰酶抑制剂)和培养体系Ⅱ(90%DMEM、10%胎牛血清、双抗、2 mmol/L谷氨酰胺+0.01%大豆胰酶抑制剂、10 mmol/L烟碱、10 ng/mL表皮细胞生长因子、15 ng/mL胰岛素样生长因子)体外培养14天,进行抗胰岛素、抗CK7双荧光染色和胰岛素刺激释放实验。结果应用培养体系Ⅰ的NPCCs体外培养14天时,抗胰岛素阳性细胞(β细胞)百分比为(28.6±5.3)%,显著低于培养体系Ⅱ的(62.1±9.0)%(P(0.01);培养体系Ⅰ的抗CK7阳性细胞(原始导管细胞)百分比为(52.8±7.2)%,显著高于培养体系Ⅱ的(21.5±6.9)%(P(0.01)。培养体系Ⅰ的NPCCs体外培养14天时胰岛素刺激释放量为:低糖:(14.3±4.8)mU/L,高糖:(23.9±6.2)mU/L,高糖+茶碱:(38.5±8.2)mU/L,显著低于培养体系Ⅱ的释放量:(26.2±5.1)mU/L、(46.3±7.0)mU/L、(81.5±10.4)mU/L(P(0.01)。结论培养体系Ⅱ较培养体系Ⅰ更能促进NPCCs中β细胞发育成熟及CK7阳性细胞向β细胞转化,并使胰岛素刺激释放量提高。培养体系Ⅱ是微囊和移植前体外培养NPCCs的理想方案之一。

微囊化新生猪胰岛细胞异种移植生物相容性和疗效的研究

目的：研究微囊化新生猪胰岛细胞异种移植影响生物相容性的因素以及对1型糖尿病的疗效。方法：注射链脲霉素诱发糖尿病大鼠模型后，将不同组微囊化新生猪胰岛细胞、未微囊化新生猪胰岛细胞及空微囊，经腹腔植入1型糖尿病大鼠体内，移植后不应用任何免疫抑制剂，测量移植后大鼠血糖、体重、胰岛素C肽的变化。结果：移植后6∽8周实验组、对照组3糖尿病大鼠血糖、体重逐渐恢复正常水平；移植后实验组、对照组1、2、3血清C肽水平升高，对葡萄糖刺激实验反应明显；胰岛素释放试验显示葡萄糖可刺激胰岛细胞释放胰岛素实验组与对照组比较有统计学意义（ p＜0．01）。结论：微囊周围细胞过度增生是导致移植物功能丧失的主要原因；微囊化新生猪胰岛细胞可以纠正糖尿病大鼠高血糖状态，在体内可以生长、分化，并增加胰岛素分泌水平。

钨酸钠促进新生猪胰岛细胞体外增殖、分化及分泌功能

目的观察钨酸钠在体外对新生猪胰岛细胞增殖及功能活性的影响。方法分离和纯化新生猪胰岛细胞后,与钨酸钠共育,隔天进行细胞计数、MTT实验,取最佳浓度300μmol/L钨酸钠与细胞共同培养3d,收集细胞进行葡萄糖刺激实验,并分别用Western blot、RT-PCR方法检测细胞内胰岛素蛋白(INSULIN)、细胞增殖核抗原(PCNA)和胰十二指肠同源框蛋-1(PDX-1)mRNA、葡萄糖转运子-2(GLUT-2)mRNA的表达。结果 300μmol/L钨酸钠处理后胰岛细胞增殖活性及葡萄糖刺激实验中胰岛素分泌明显高于对照组(P<0.05),钨酸钠干预组PCNA蛋白和IN-SULIN蛋白表达分别为2.24±0.19和1.62±0.17,显著高于对照组的1.17±0.13和0.37±0.08(P<0.05,P<0.01);PDX-1和GLUT-2 mRNA表达分别为0.34±0.05和1.06±0.10,显著高于对照组的0.11±0.03和0.13±0.02(P<0.01)。结论低浓度(300μmol/L)钨酸钠具有促进新生猪胰岛细胞增殖分化、增强胰岛细胞功能、促进胰岛素分泌的作用。

不同培养基对干细胞-胰岛复合物培养后形态和功能的影响

探讨3种培养基对干细胞包被胰岛形态和功能的影响。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)、新生猪胰岛细胞(neonatal porcine islet cell clusters,NICCs)混合后分别用NICC培养基(A组)、MSC培养基(B组)、EPC培养基(C组)培养,观察各组中NICCs形态、分泌功能、基因表达水平及混合细胞凋亡率。C组破碎细胞数量明显比A、B两组少,凋亡率低,胰岛素和胰高血糖素基因的mRNA相对表达量高(P<0.05)。EPC培养基对NICCs的保护作用最优。

人类间充质干细胞来源的外泌体对猪胰岛抗缺氧能力的影响

目的探讨来自人类脐带源间充质干细胞条件培养基(human umbilical cord-derived MSCconditioned medium,Hu-MSC-CM)中的外泌体能否增加新生猪胰岛细胞(neonatal porcine islet cell clusters,NICCs)在缺氧环境下的生存和功能。方法 NICCs在低氧条件下(1%O_2)分别用含外泌体的条件培养基、去除外泌体的条件培养基和常规培养基进行培养。荧光激活细胞分选仪和细胞外通量测定法分别检测外泌体对细胞活性和功能的影响,实时定量PCR检测NICCs中缺氧耐受相关基因HIF-1α、PDH2及VEGF的表达。结果与常规培养基组和去除外泌体的条件培养基组相比,含外泌体的条件培养基组培养的NICCs其存活率、活性和功能均有所提高[IEQ:7 800±210比5 894±188、4 740±273,P <0.001;β细胞存活率(%):77.2±7.0比68.8±1.8、61.5±5.1,P <0.05]。含外泌体的条件培养基组孵育的NICCs细胞中HIF-1α、PDH2及VEGF基因表达均显著高于另外两组。结论人类脐带源MSC-条件培养基可以减轻NICCs在缺氧过程中导致的功能障碍,外泌体在诱导低氧抵抗方面发挥重要作用。

人脐带间充质干细胞条件培养基对缺氧胰岛的保护作用

为了探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)通过旁分泌作用对缺氧胰岛的保护,将新生猪胰岛细胞团(neonatal porcine islet cell clusters, NICCs)分别用人脐带间充质干细胞条件培养基(human umbilical cord-derived MSC-conditioned medium, hu-MSC-CM)及常规RPMI1640培养基(对照组)置于20%O_2和1%O_2的环境中培养。通过荧光激活细胞分类器、Seahorse线粒体应激实验检测不同培养基对缺氧NICCs活性、功能的影响,利用Western-blot检测缺氧时NICCs生存相关蛋白质的表达水平。实验结果显示,缺氧时hu-MSC-CM组中NICCs细胞得率、活性及功能较对照组均有明显改善(P<0.05);实验组中缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)表达上调,凋亡及自噬相关蛋白质表达下降。实验结果表明间充质干细胞通过旁分泌作用能有效提高缺氧胰岛的活力和功能。