Thermotoga nea politana葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及其酶学性质

目的：从新阿波罗栖热袍菌Thermotoga neapolitana（DSM4359）中克隆葡萄糖苷酶基因，并将其转化进大肠杆菌中进行体外表达，研究重组酶的酶学性质。方法：以Thermotoga neapolitana基因组DNA为模板，根据该基因序列设计引物，采用PCR法扩增出葡萄糖苷酶基因，将其连接到pET-28a（4-）载体上，转化入E．coli BL21（DE3）宿主菌中。经IPTG诱导体外高效表达。研究重组酶的最适反应温度、pH值和底物特异性。结果：PCR扩增得到825bp的片段，编码274个氨基酸，并连接到载体pET-28a（＋）上，成功转化到宿主菌中。并在体外进行了高效表达。丙烯酰胺凝胶电泳，目标蛋白相对分子质量约为63000。重组酶的最适反应温度为75℃，在70℃～85℃范围内仍保持60％以上活力。最适反应pH值为5．0，在pH3．0～6．0范围内仍能保持70％以上活力。最适底物为海藻糖，其次为龙胆二糖，其他糖苷键连接的二糖的活力均很低或没有活力。结论：Thermotoga neapolitana（DSM4359）中葡萄糖苷酶基因成功克隆并表达于大肠杆菌中。葡萄糖苷酶能特异性水解α-（1→1）糖苷键。

Thermotoga neapolitana α-葡萄糖苷酶基因克隆及表达

本文拟克隆新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)的一种α-葡萄糖苷酶基因(TNAG),其GenBank注册号为lcl27401。首先以T.neapolitana DSM 4359基因组DNA为模板,通过PCR扩增目的基因并完成T克隆,在NCBI数据库中比对结果表明:目的基因与Thermotoqa sp.RQ2等氨基酸序列相似度高于99%。再将目的基因连接至表达载体pET-32a(+),并导入大肠杆菌Rosetta中用IPTG诱导表达。SDS-PAGE显示表达蛋白的大小约为72KDa。热纯化后酶液测活反应的最适温度为80℃,最适pH在5.0左右。