施万样细胞对大鼠脊神经节NGF和BDNF表达的影响

目的观察施万样细胞对坐骨神经损伤(sciatic nerve injury,SNI)大鼠脊神经节NGF和BDNF表达的影响,初步探讨施万样细胞对脊神经节的保护作用。方法先将脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)诱导分化为施万样细胞并对后者进行鉴定,后将二者分别植入脱细胞神经移植物(ANA)中,构建组织工程神经。大鼠随机分为正常对照组、ADSC组和施万样细胞组。后两组建立SNI模型并用相应的组织工程神经桥接损伤的神经。术后4周采用Western Blot和Real-time PCR检测各组大鼠脊神经节神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor,BDNF)蛋白和m RNA的表达。结果 ADSCs能够诱导分化为施万样细胞并表达施万细胞标记物S100β和GFAP蛋白。施万样细胞组大鼠脊神经节内NGF和BDNF蛋白及m RNA表达量均高于ADSC组(P<0.05)。结论施万样细胞可上调脊神经节NGF和BDNF的表达,对SNI所致的脊神经节内神经元损伤有保护作用。

大鼠脂肪源性干细胞来源的施万样细胞的增殖能力

目的:通过检测大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs)来源的施万样细胞的增殖能力,探讨其在神经修复再生领域的应用及其意义。方法:取大鼠附睾旁脂肪组织进行ADSCs的分离与培养;将第4代ADSCs在β-巯基乙醇(β-ME)、反式维甲酸(ATRA)、血小板衍生因子AA(PDGF-AA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、腺苷酸环化酶激活剂(Forskolin)和Heregulin-β的联合作用下诱导分化为施万样细胞。采用免疫荧光法、Western blotting法和Real-time PCR法检测施万细胞(SCs)标记物S-100β、P75和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达水平;采用MTT法检测施万样细胞的增殖能力,观察其有丝分裂增殖现象。结果:诱导分化后的施万样细胞呈梭形、栅栏样排列。S-100β、P75和GFAP蛋白免疫荧光为Cy3/FITC标记,阳性产物位于细胞浆及其突起。Western blotting和Real-time PCR法检测,施万样细胞中S-100β、P75和GFAP蛋白和mRNA表达水平明显高于ADSCs(P<0.01)。MTT法检测,施万样细胞有较强的有丝分裂增殖能力。结论:ADSCs能够成功被诱导分化为施万样细胞,并表达SCs标记物;施万样细胞有较强的有丝分裂增殖能力,可作为神经组织工程理想的种子细胞。

人神经干细胞源施万样细胞微囊泡促进大鼠神经元轴突生长

目的:探究人神经干细胞源施万样细胞微囊泡对大鼠神经元轴突生长的影响。方法:选取出生4~5 d的SD大鼠乳鼠,摘取背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),获得DRG神经元;用施万样细胞微囊泡刺激DRG神经元,行βⅢ-微管蛋白免疫荧光染色,观察轴突生长情况;分别用0、5、20、40 mg/L施万细胞微囊泡刺激神经元样N2a细胞19 h,用荧光定量PCR检测N2a细胞生长相关蛋白43(growth associated protein 43,GAP43) mRNA表达;分别用0、20、40 mg/L施万细胞微囊泡刺激N2a细胞48 h,行过碘酸-雪夫染色,检测细胞内糖原生成情况。结果:施万样细胞微囊泡组的DRG神经元轴突长度明显长于PBS组(P <0. 05)。施万样细胞微囊泡可被N2a细胞吞噬。与0 mg/L组相比,5 mg/L组GAP43 mRNA表达差异无统计学意义(P> 0. 05);20、40 mg/L组GAP43 mRNA表达量、突起增长率及碘酸-雪夫染色细胞阳性率均明显高于0 mg/L组(P均<0. 05)。结论:施万细胞微囊泡在体外能够促进大鼠神经元轴突生长。

白藜芦醇联合施万细胞样细胞对大鼠坐骨神经损伤的修复作用

目的:探讨白藜芦醇联合脂肪源性干细胞(ADSCs)分化的施万细胞样细胞(SCLCs)对大鼠坐骨神经损伤的修复作用。方法:ADSCs原代培养并向SCLCs诱导分化,扫描电镜观察细胞形态;Western Blot方法检测S100钙结合蛋白β(S100β)、p75神经营养素受体(p75NTR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。大鼠随机分为对照组(Control)、施万细胞样细胞组(SCLCs)、白藜芦醇组(Res)、白藜芦醇+施万细胞样细胞组(Res+SCLCs),坐骨神经损伤模型造模成功后8周通过足迹实验检测各组坐骨神经功能指数(SFI);von Frey丝刺激针测定机械缩足阈值(MWT);称重法测定胫前肌湿重比率(WR);Western Blot、RT-qPCR方法检测损伤处神经营养素-3(NT-3)、神经生长因子(NGF)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)和脑源性神经营养因子(BDNF)表达情况。结果:ADSCs诱导8 d后细胞两极细长,细胞外成分增多;S100β、p75NTR、GFAP蛋白高表达。给予SCLCs、Res及Res+SCLCs治疗后,治疗组SFI、WR明显优于Control组(P<0.05);Res+SCLCs组、SCLCs组大鼠MWT降低(P<0.05)。Western Blot结果显示:Res+SCLCs组大鼠NT-3、IGF-1、NGF、BDNF蛋白表达高于其余各组(P<0.05);SCLCs组大鼠NT-3、NGF、BDNF蛋白表达高于Control组(P<0.05);Res组大鼠NT-3、NGF蛋白表达高于Control组(P<0.05)。RT-qPCR结果显示:Res+SCLCs组大鼠NT-3、IGF-1、NGF、BDNF mRNA高表达;SCLCs组大鼠NT-3、IGF-1、NGF、BDNF mRNA表达高于Control组(P<0.05);Res组大鼠IGF-1、NGF mRNA表达高于Control组(P<0.05)。结论:Res联合ADSCs分化的SCLCs对大鼠坐骨神经损伤具有良好的修复作用。

鼻粘膜干细胞来源施万样细胞与PC12高分化细胞共培养研究

[目的]研究大鼠鼻粘膜来源干细胞(REMSCs)分化为施万样细胞与PC12高分化细胞共培养后髓鞘形成及轴突生长情况。[方法]取大鼠鼻甲组织分离、培养及鉴定REMSCs,使用Heregulin、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子和Forskolin将REMSCs诱导分化为施万样细胞。将分化后形成的施万样细胞与PC12高分化细胞共培养。倒置显微镜下观察形态,免疫细胞化学染色检测细胞表面标志,电镜观察髓鞘形成能力,Western blot检测MBP。[结果]大鼠REMSCs表达外胚层标志物:nestin,SOX10和Vimentin。REMSCs诱导后形成的施万细胞成双极纺锤状,并且能够在体外持续增殖。倒置显微镜观察到施万样细胞沿PC12高分化细胞轴突生长并且促进PC12高分化细胞轴突延长,电镜显示施万样细胞和PC12高分化细胞形成髓鞘样结构。Western blot显示MBP在共培养3,6,9 d呈递增趋势。[结论]从下鼻甲分离的REMSCs诱导后可形成施万样细胞,施万样细胞具有形成髓鞘及促进轴突生长能力。

大鼠脂肪源性干细胞定向分化为施万细胞样细胞的实验研究

目的研究体外培养成年大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs)并诱导分化为施万细胞样细胞的潜能。方法分离、培养成年SD大鼠ADSCs,免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原CD44,CD49d和CD106。传6～8代的ADSCs接种在多聚赖氨酸铺板的培养板内,用含5ng/ml血小板源性生长因子,10ng/ml牛碱性成纤维细胞生长因子,14μmol/LForskolin,200ng/mlHeregulin及10%FBS的DMEM/F12培养基诱导分化12d,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标记物GFAP,S-100和P75。结果分离纯化的ADSCs呈CD44和CD49d阳性,而CD106表达为阴性;诱导后的细胞呈梭形,并表达施万细胞特异性标志蛋白-GFAP,S-100和P75。结论从大鼠脂肪组织能获得具有增殖和分化潜能的干细胞,这些细胞在特定条件下可定向诱导分化为施万细胞样细胞。

施万细胞样细胞对大鼠背根神经节细胞突起生长和神经生长因子表达的影响及其机制

目的:探讨施万细胞样细胞(SCLCs)对大鼠背根神经节(DRG)细胞突起生长和神经生长因子(NGF)表达的影响,阐明SCLCs促进DRG细胞生长的作用及其机制。方法:分离培养脂肪源性干细胞(ADSCs),茜素红染色检测细胞中钙化结节从而观察其分化能力,将其诱导分化为SCLCs,免疫荧光法检测SCLCs中S100蛋白的表达。分离培养DRG细胞,免疫组织化学染色检测DRG细胞中神经元核抗原(NeuN)蛋白的表达。建立SCLCs与DRG细胞共培养体系,将细胞分为单培养组和共培养组。HE染色观察2组DRG细胞的形态结构,计数2组DRG细胞数和DRG细胞突起数,免疫组织化学染色检测2组DRG细胞中NGF蛋白的表达,Western blotting法检测2组DRG细胞中NGF蛋白表达水平。结果:原代ADSCs培养7 d,倒置显微镜下可见数量较多、体积较大、呈长梭形的细胞类似旋涡状或铺路石样排列。茜素红染色,镜下可见钙化结节,即所培养细胞具有分化能力。免疫荧光染色,大多数细胞均呈S100染色阳性,即ADSCs可成功诱导分化为SCLCs。培养72 h后,DRG细胞突起细而长、呈花环样排列,7~8 d后,细胞数量进一步增加,胞体较大,呈圆形,突起细长,相互连接似栅栏样。免疫组织化学染色,几乎所有细胞核均被标记为棕褐色,呈NeuN染色阳性。与单培养组比较,共培养组DRG细胞数及细胞突起数均明显增加(P<0.05),共培养组DRG细胞中NGF蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:共培养条件下SCLCs可增加DRG细胞数和细胞突起数,提高DRG细胞中NGF蛋白的表达,发挥促进DRG细胞生长的作用。

大鼠骨髓基质细胞分化为施万细胞样细胞过程中的基因表达变化

目的:利用转录组测序技术(RNA-seq)检测骨髓基质细胞(BMSCs)分化为施万细胞(SCs)样细胞过程中基因表达谱的变化,筛选与分化相关的差异表达基因,并分析与分化相关的信号通路。方法:体外培养大鼠BMSCs,用三步诱导法对其进行诱导,在复合生长因子诱导第12 h和7 d收集样本。经Illumina测序平台对BMSCs、诱导培养基(DM)诱导12 h(DM-12 h)和7 d(DM-7 d)的细胞进行生物信息分析,采用Cluster Profiler软件对差异基因集进行GO功能和KEGG代谢通路富集分析。结果:与BMSCs组相比,DM-12 h组有578个基因表达上调,632个基因表达下调;与DM-12 h组相比,DM-7 d组有1165个基因表达上调,872个基因表达下调;与BMSCs组相比,DM-7 d组有629个基因表达上调,529个基因表达下调。经Venn分析,共筛选出140个在各阶段共同表达的差异基因,其中与分化相关的基因主要富集在细胞周期、DNA复制和p53信号通路;并确定Ccne2、Mcm3和Rrm2可作为下一步研究的候选基因。结论:本研究首次基于转录组测序构建BMSCs诱导分化为SCs样细胞的基因表达谱,揭示分化过程中的差异基因,并筛选出Ccne2、Mcm3和Rrm2作为研究目的基因,为阐明BMSCs分化为SCs样细胞的机制提供依据。

施万细胞样细胞对大鼠背根神经节细胞突起生长的影响

目的:通过建立施万细胞样细胞(SC-L)与幼年大鼠背根神经节(DRG)细胞共培养体系,观察DRG细胞突起的生长情况以及检测脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。方法:采用0.1%的I型胶原酶分离培养脂肪源性干细胞(ADSCs)并进行鉴定,然后将其诱导分化为SC-L。分离培养DRG细胞,后将其分为单独培养组(DRG)和共培养组(DRG+SC-L)。DRG组将两份等体积的DRG细胞混合,常规培养;DRG+SC-L组将等体积的DRG细胞与SC-L进行共培养处理。7~10 d后采用苏木素-伊红(HE)染色观察两组DRG细胞的形态,免疫荧光和Western Blot技术检测DRG细胞内BDNF蛋白的表达。结果:与DRG组相比,DRG+SC-L组DRG细胞的数量以及突起的数目和长度明显增加、细胞内BDNF蛋白表达量明显升高(P <0.05)。结论:SC-L可增加DRG细胞的数量以及突起的数目和长度,并可提高细胞内BDNF蛋白的表达。