施氏假单胞菌A1501铁吸收调节蛋白Fur的表达特性与功能鉴定

铁是细胞生理代谢的重要金属元素,是多种氧化还原酶类、过氧化物酶类的重要组成部分。革兰氏阴性菌中,胞内铁转运、储存和利用主要由铁吸收调节蛋白Fur(ferric uptake regulator)调控。水稻根际联合固氮菌--施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501基因组中含有一个fur同源基因,但其具体功能尚不清楚。比较了A1501中fur基因及其编码蛋白的序列特征,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative,qRT-PCR)和Western blotting杂交方法测定了fur基因和Fur蛋白的表达特性,结果发现fur基因表达水平与环境中铁浓度呈负相关,在铁限制条件下高表达,铁过量条件下表达受抑制。构建了fur基因突变株和功能回补株,表型测定发现fur突变影响了A1501的碳源代谢谱,并导致A1501对过氧化氢胁迫敏感。胞内铁含量测定表明,fur突变株内的铁含量为野生型的1.3倍,进一步qRT-PCR测定表明fur突变影响了铁离子转运系统及过氧化物酶编码基因的表达。研究结果为解析根际微生物胞内铁平衡调节及根际环境适应机制奠定了理论基础。

施氏假单胞菌菌剂的好氧生长条件优化及其短程反硝化性能

短程反硝化是目前生物脱氮技术的研究热点之一,但有关短程反硝化菌剂的研究仍较为匮乏.该文从污水厂活性污泥中分离了1株兼具异养氨氧化能力和短程反硝化能力的施氏假单胞菌(Stutzerimonas stutzeri WH-01).通过单因素优化试验,逐步确定了WH-01菌剂在好氧条件下的最适生长参数:以300 mg·L^(-1)氨氮为氮源、以1500 mg·L^(-1)葡萄糖为碳源、培养温度为35℃,初始pH为8.0.以乙酸钠为碳源时,WH-01菌剂虽具有全程反硝化能力,但会优先进行短程反硝化:在培养基中的亚硝氮积累效率为81%,在实际污水中的亚硝氮积累效率为97%.上述结果表明WH-01菌剂具有工程应用的潜力.

固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501同化硝酸盐代谢基因簇分布及调控研究

固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501在有氧条件下能够利用硝酸盐/亚硝酸盐为唯一氮源生长,表明该菌除了具有固氮和反硝化等氮循环系统外还有同化硝酸盐/亚硝酸盐系统。为进一步阐明该菌同化硝酸盐的代谢机制,利用生物信息学手段分析了硝酸盐同化相关基因的组成及分布情况,并初步研究了同化硝酸盐途径特异性调控关系。结果表明,P.stutzeri A1501中存在两个硝酸盐同化基因簇nasST-nasA-nirBDnasBcobA和nasR-nasFED,分布于基因组不同部位。第一个基因簇中nasS-nasT编码二元抗转录终止因子,nasA编码NarK/NasA家族硝酸盐转运蛋白,nirBD编码亚硝酸盐还原酶,nasB编码同化硝酸盐还原酶,cobA编码参与西罗血红素合成的尿卟啉-ⅢC-甲基转移酶;第二个基因簇中nasR编码单一组分抗转录终止因子,nasFED编码ABC型(ATP依赖)硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白。NasS-NasT双组分蛋白调控硝酸盐/亚硝酸盐还原酶基因的转录,NasR调控硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白基因的转录。

固氮施氏假单胞菌A1501四碳二羧酸结合蛋白DctP的功能及表达特性

【目的】研究施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501四碳二羧酸结合蛋白Dct P的生物学功能和自身表达特性。【方法】构建结合蛋白编码基因dct P的非极性突变株,测定dct P突变株以不同四碳二羧酸(琥珀酸延、胡索酸、苹果酸)为唯一碳源时的生长情况和固氮酶活性;构建dct P基因启动子的融合表达载体dct P-lac Z,将其分别转入野生型A1501和ntr BC、rpo N和dct B突变株中,测定在不同四碳二羧酸为唯一碳源诱导条件下重组菌株中的β-半乳糖苷酶活性。【结果】dct P基因的突变使菌株丧失了四碳二羧酸的利用能力,影响了菌株的固氮酶活性;苹果酸、延胡索酸、琥珀酸对dct P-lac Z具有明显的诱导作用;在rpo N、ntr BC和dct B突变株中,dct P的表达量均显著降低。【结论】Dct P蛋白在四碳二羧酸的利用过程中起重要的作用,dct P基因的表达是Rpo N依赖型,可被四碳二羧酸诱导,受到调控蛋白Ntr BC/Dct B的协同调控。

柠檬酸钠-施氏假单胞菌还原制备纳米银及抑菌活性研究

以硝酸银为原料,利用柠檬酸钠联合施氏假单胞菌还原法制备纳米银,并对纳米银的紫外吸收特性、微观形貌、物相组成,以及其稳定性和抑菌性进行了分析。结果表明,与单独柠檬酸钠制备的纳米银相比,联合还原法制备的纳米银有明显的紫外吸收峰,其粒径的整体大小减小了约10倍,稳定性同步增强,制备效率提高了26.7%;抑菌实验表明,联合法制备的纳米银对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌性分别提高了62.5%和77.5%。

非生物胁迫条件下施氏假单胞菌生物膜形成规律的研究

旨在系统研究非生物胁迫因素对固氮施氏假单胞菌A1501生物膜形成能力的影响,测定了不同NaCl浓度、pH值、温度等培养条件下A1501生长及其生物膜形成能力的变化规律。结果显示,上述3种环境因素均对A1501菌的生长及生物膜形成具有影响,且呈现出一定的规律性。NaCl浓度2 mmol/L、p H值6.8、温度30℃是A1501的最适生长条件,而在0.6 mol/L的NaCl、p H值6.0及温度40℃等胁迫条件下,A1501菌的生物膜形成量均达到最高,分别为最佳生长条件下的7.8、7.0和2.0倍。在测试的诸因素中,NaCl浓度对A1501生物膜形成影响最大。以上结果表明,生物膜的形成与菌体生长负相关,即高盐、弱酸、高温等条件不利于A1501的生长,但刺激了其生物膜的形成。

施氏假单胞菌在玉米根际的固氮效率和促生效果研究

非豆科植物根际联合固氮作用广泛存在于水稻、玉米等根际,在农作物节肥增产方面具有巨大的应用潜力。施氏假单胞菌A1501是一株分离自水稻根际的模式联合固氮菌,接种该菌对水稻和玉米均具有良好的促生效果。为了进一步研究根际固氮与促生效果的关系,利用突变型泌铵固氮菌株(1568/pVA3)和转基因氮高效利用玉米品系共同构建高效固氮体系,并在温室条件下进行促生及生物固氮量评价。播种60 d后对玉米生长量和微生物固氮量进行分析,结果表明:固氮施氏假单胞菌接种后氮高效利用和对照玉米品系的地上和地下部生物量都显著高于不接种对照,但是固氮菌接种对氮高效利用玉米和对照玉米的总生物量没有显著影响。氮高效利用玉米接种1568/pVA3菌株后,植株生物量较施肥处理提高25.5%,全氮含量较不接种对照增加39%,15N同位素稀释法测定生物固氮量为0.8 g·株^(-1);接种野生型后植株生物量较施肥处理提高24.8%,生物固氮量为0.64 g·株^(-1)。研究结果表明,通过将固氮菌尤其是泌铵工程菌与氮高效利用玉米建立联合固氮体系可以显著提高根际固氮量和植株生物量,据估算每公顷可节省化肥约23%,而对照体系为7.5%。

施氏假单胞菌对二苯并噻吩的降解

从胜利油田油井附近土壤中筛选到 1 株施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri UP1),可把二苯并噻吩(DBT)降解成水溶性硫化物,静息细胞实验证实该菌株细胞内存在能够降解DBT的酶系,降解过程的某些中间产物及终产物与已知的Kodama 路线相同,表明此菌株对DBT的降解是以 Kodama 路线进行的.

施氏假单胞菌F4产黄曲霉毒素B_1降解酶条件的优化

在前期工作中分离到可高效降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的施氏假单胞菌F4,本实验对其产AFB1降解酶的发酵条件进行考察和优化,选择与产酶相关的种龄、接种量、起始pH值、发酵时间以及发酵温度5个因素,以AFB1降解酶酶活力为评价指标,在单因素试验的基础上,通过三因素三水平的Box-Behnken响应面分析法优化施氏假单胞菌发酵产AFB1降解酶的条件。结果表明,在接种量和起始pH值分别为3%和6.5时,最优发酵条件为种龄10.47h、发酵时间42.52h、发酵温度30.28℃,在此发酵条件下,酶活力可达到2768.7U,比优化前提高了28.99%。

施氏假单胞菌JHY01菌株毒死蜱降解酶的定位及其提取条件的优化

对具有降解有机磷农药毒死蜱作用的施氏假单胞菌JHY01菌株的降解酶进行定位,测得其胞外酶、胞内酶、细胞碎片中残留酶对毒死蜱的降解率分别为8.41%、79.85%、77.14%。由此确定该菌株的有机磷降解酶主要为胞内酶。采用超声波破碎方法提取降解酶,对降解酶提取条件进行正交优化,结果显示,最佳超声波(超声波碎仪Sonics-VCX500,功率500W,频率20kHz)破碎条件是:菌体重量:缓冲液体积为1:4(g/ml),总辐射次数30次,每次辐射4s,间隔4s。在此条件下所提取的粗酶液酶活力最高,对毒死蜱的降解效率可达84.47%。

施氏假单胞菌F4对黄曲霉毒素B_1的酶解作用及其降解产物的初步分析

施氏假单胞菌F4能高效降解黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)。研究了F4的AFB1降解活性、降解动力学以及蛋白酶K和SDS对其降解性能的影响。F4细胞悬液与毒素共培养72 h后降解率达80.03%;蛋白酶K处理对降解率没有影响,SDS处理的细胞悬液基本丧失了降解活性。不同时间点的降解液上清液仍能有效降解残留AFB1,其中以60 h的降解液上清液活性较好,与残留AFB1继续作用48 h后降解率达84.30%;而经蛋白酶K处理后降解率仅为45.42%。低浓度AFB1诱导对菌体的降解活性没有影响。上述结果提示,F4通过胞内酶作用降解AFB1。高效液相色谱对产物分析表明,F4可将AFB1酶解为至少2种产物。

施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri产卡拉胶酶液体发酵条件优化

以从红树林底泥中分离筛选的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)为对象,采用单因素和正交实验方法,通过摇瓶发酵方式对其产卡拉胶酶发酵条件进行了研究。得到最佳培养基配方和培养条件分别如下:卡拉胶0.3‰,酵母浸粉0.1‰,NaNO30.3‰,乳糖0.04%,吐温-800.2‰;起始pH值6.0,温度32℃,装样量90mL/250mL,接种量13%,摇床转速160r/min。在最佳条件下,发酵液的酶活力为26.5U/mL,比优化前的活力提高了80%。

大肠杆菌氮代谢调节蛋白GlnG与固氮施氏假单胞菌氮代谢调节蛋白NtrC的功能互补研究

旨在围绕大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)中氮代谢调节蛋白GlnG与施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeriA1501)中氮代谢调节蛋白NtrC在一般氮代谢调控网络中是否存在功能互补展开研究。利用DH10B菌的glnG基因回补A1501菌的ntrC突变株,以及A1501菌的ntrC基因回补DH10B菌的glnG突变株,对所获得的功能互补株分别展开生理生化表型测定。结果表明,在以硝酸钾或尿素为唯一氮源的培养条件下,DH10B glnG基因可以回补A1501ntrC突变株的氮源利用能力,并且部分恢复ntrC突变株的固氮酶活性(约为野生型A1501固氮酶活性的45%);与DH10B glnG突变株相比,A1501菌的ntrC基因回补了DH10B glnG突变株以精氨酸为唯一氮源的生长能力。以上结果说明DH10B菌的GlnG蛋白与A1501菌的NtrC蛋白不仅在进化关系上紧密联系而且在所测试的氮代谢途径中存在功能互补。

施氏假单胞菌YC-YH1对甲基对硫磷的降解及其代谢产物检测

利用实验室已获取的菌株YC-YH1对甲基对硫磷进行降解,以高效液相色谱结合质谱分析(HPLC-MS)测定菌株YC-YH1对甲基对硫磷的降解速率并检测其代谢产物,通过基因克隆研究菌株YC-YH1对甲基对硫磷降解的分子机制,同时分析代谢产物对菌株YC-YH1生长的影响。结果表明,菌株YC-YH1为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),能够高效降解甲基对硫磷,其同时含有甲基对硫磷水解酶基因mpd和有机磷水解酶基因oph C2。经质谱分析确定,菌株YC-YH1将甲基对硫磷水解为对硝基苯酚和二甲基硫代硫酸酯,其中对硝基苯酚显著抑制YC-YH1的生长。综上,施氏假单胞菌YC-YH1能够高效地降解甲基对硫磷,但对硝基苯酚作为其代谢产物对YC-YH1的生长存在显著抑制作用。

施氏假单胞菌UP-1降解二苯并噻吩的动力学模型

对施氏假单胞菌(UP-1)降解二苯并噻吩(DBT)的过程进行了宏观动力学研究,以Michaelis-Menten方程为基础确定了UP-1降解DBT的动力学模型。计算得到动力学参数vmax=84.75 mg/(L.h),Km=759.59 mg/L。通过相关指数R2和F值检验,该动力学模型高度显著,2个重要参数取值可信。在考察的底物浓度范围内菌株UP-1降解DBT过程不存在底物抑制作用,但存在产物抑制作用。求得的UP-1休止细胞降解DBT的最大降解速率为88.5 mmol/(kg DC.h),其降解脱硫能力优异。

施氏假单胞菌菌株的脱氮特性

对一株具有异养硝化-好氧反硝化功能的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株WIT-1进行研究,初步探讨了菌株WIT-1的脱硝态氮能力、对硝态氮的最高耐受性及在未灭菌生活污水的实际脱氨氮效果.结果表明,在初始化学需氧量(Chemical Oxygen Demand,COD)为500 mg/L时,48 h对硝态氮的去除率为96.38%.在相同COD条件下,菌株WIT-1对脱硝态氮耐受性为800 mg/L.当菌株WIT-1的接种量为2%时,12 h对生活污水中的氨氮去除率为32.741%.当初始COD含量增加到500 mg/L或者菌株的接种量提高为8%时,12 h对生活污水中的氨氮去除率分别为52.765%和100%.但48 h对氨氮的去除率都只有20%左右.

施氏假单胞菌N2降解1-羟基-2萘甲酸的特性及机理研究

1-羟基-2-萘甲酸被认定为微生物修复多环芳烃(PAHs)污染过程中最易积累的一种含氧多环芳烃(OPAHs)中间产物,其对大多微生物有较强毒性,并且该物质的积累会抑制微生物对PAHs污染环境的成功修复.本文以施氏假单胞菌N2为对象,研究该菌株对1-羟基-2-萘甲酸的降解代谢能力和特性,并利用GC-MS对降解过程中积累的OPAHs进行鉴定和分析.研究结果表明,N2菌能够以50 mg/L卜羟基-2-萘甲酸为唯一碳源和能源生长,并在以辛烷为共代谢碳源时其生长量和卜羟基-2-萘甲酸的降解率均可提高20%.通过对9种主要中间代谢产物的GC·MS分析,推测脱羧是N2菌降解1-羟基-2-萘甲酸的主要途径.该研究结果将为解决PAHs污染环境修复过程中OPAHs类高毒中间产物积累问题奠定基础.

施氏假单胞菌应用于IPS技术的可行性试验研究

为探究利用施氏假单胞菌代谢产物——氮气加固可液化砂土的可行性,对该菌反硝化作用的条件与砂样中产气效能进行了研究,分析了不同碳源对NO_3^--N与NO-2-N还原率的影响以及温度和初始p H值对其最终饱和度、平均产气速率、初始停滞期的影响,并确定了最优碳源、适用温度和初始p H值区间.试验结果表明,柠檬酸钠为最优碳源,该菌在21 h时对NO_3^--N还原率达到100%,NO-2-N存在先累积后还原的过程,并伴有0.82 mmol/L残留浓度.该菌在4~30℃下均可产气.随温度升高,平均产气速率大幅增加,砂样最终饱和度略有降低.恒温20℃且初始p H值为5~9时,该菌可在砂样中顺利产气.中性及碱性环境下砂样的最终饱和度基本一致,酸性环境下砂样的最终饱和度随初始p H值的减小而降低,细菌在砂样中的平均产气速率随初始p H值的下降而减小.与已有微生物气法相比,将该菌应用于IPS技术中具有平均产气速率快、初始停滞期短、工艺简单等优点.

施氏假单胞菌氮代谢调控蛋白GlnK与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作研究

细菌中PⅡ蛋白是一类氮代谢调控因子,可通过感知胞内碳氮信号变化调整自身与靶蛋白的相互作用,从而实现对下游基因的级联调控。α-酮戊二酸是胞内碳状态的重要信号分子,前期研究发现PⅡ蛋白可结合α-酮戊二酸感应细胞内的碳状态,但不同菌中二者的结合存在差异。施氏假单胞菌A1501(Pseudomononas stutzeri A1501)只含有1种PⅡ蛋白GlnK,其在A1501固氮调控中发挥重要作用,但具体碳信号感知与转导机制有待进一步探索。基于此,通过大肠杆菌外源表达GlnK蛋白,并通过微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)方法研究GlnK蛋白与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作,发现二者可以体外结合,且进一步证实GlnK蛋白的第89位甘氨酸(G89,Gly89)可能与互作相关。研究结果为进一步解析α-酮戊二酸在A1501中的信号转导奠定了基础,也为深入解析固氮菌的碳氮代谢偶联机制提供了理论支持。

节杆菌与施氏假单胞菌对甲基对硫磷的共降解研究

为实现对有机磷农药甲基对硫磷的彻底降解,研究利用有机磷农药降解菌施氏假单胞菌YC-YH1与对硝基苯酚降解菌CN2对甲基对硫磷进行共降解试验,同时克隆了参与降解过程的相关基因,并对2株菌株在对甲基对硫磷污染土壤的原位修复中的效果进行研究。结果表明,与YC-YH1单独降解相比,YC-YH1和CN2共降解在处理前32 h无较大差异;但之后,甲基对硫磷和对硝基苯酚的降解速度明显加快,处理48 h后甲基对硫磷即被完全降解,比单独用YC-H1降解时提前了16 h,处理64 h时对硝基苯酚就被完全降解。而土壤修复的研究结果表明,菌株YC-YH1与CN2能够高效降解甲基对硫磷,72 h对土壤中100 mg/kg甲基对硫磷的降解率接近100%,尤以未灭菌土壤中降解效果更好。