旋覆花内酯抑制AD模型大鼠海马环加氧酶2和核转录因子κB的表达

目的观察旋覆花内酯（l-O-acetylbfitannilactone，ABL）对Aβ25-35海马内注射所致阿尔采末病（Alzheimers disease，AD）模型大鼠海马环加氧酶2（COX-2），核转录因子KB（NF-kB）表达的影响，探讨其对AD大鼠的治疗作用及机制。方法30只SD大鼠随机分为对照组、模型组及药物处理组，Aβ25-35海马内注射制备AD大鼠模型，药物处理组给予ABL26mg·kg^-1·d^-1，模型组给予等量溶剂，分两次灌胃，共21d。用Morris水迷宫测定大鼠的学习记忆能力，免疫组化及Western blot测定大鼠海马COX-2，NF-kB蛋白表达。结果AD大鼠在定位航行试验中，逃避潜伏期延长，单位时间内跨越原平台次数减少，空间记忆力受损，与对照组及药物处理组大鼠比较差异有统计学意义（P〈0．05）；于试验d2、3、4药物处理组与对照组大鼠比较差异无统计学意义（P〉0．05）。模型组海马COX-2、NF-kB表达升高（P〈0．05），分别是对照组的2．8倍和1．6倍，药物处理组COX-2、NF—kB表达下降，与模型组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论ABL的抗炎作用可能是其改善AD大鼠学习记忆能力的作用机制之一。

1-氧-乙酰大花旋覆花内酯对照品的制备及其在欧亚旋覆花中的含量测定

从欧亚旋覆花的氯仿提取物中分离制备了1-氧-乙酰大花旋覆花内酯对照品,经紫外光谱、红外光谱、核磁共振和质谱确定结构,其相关数据与文献一致,纯度为99.5%,符合中药化学对照品含量测定用要求.以所制备的1-氧-乙酰大花旋覆花内酯为对照品,建立了用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定欧亚旋覆花中1-氧-乙酰大花旋覆花内酯含量的方法.色谱条件为Hypersil ODS-2色谱柱,流动相为甲醇-水(体积比为52:48),流速为1.0 mL/min.ELSD的漂移管温度为90 ℃,载气(空气)流速为2.5 L/min.1-氧-乙酰大花旋覆花内酯在进样量为1.37～8.21 μg时与其峰面积的线性关系良好(r=0.999 8).平均加样回收率为100.2%,相对标准偏差(RSD)为1.3%(n=6).该法准确,简单,省时,重复性好,适用于欧亚旋覆花的质量控制.

大花旋覆花内酯通过抑制NF-κB活化抗血管炎症反应

目的:以离体培养的血管环为研究对象,探讨大花旋覆花内酯(1-O-acetylbritannilactone,ABL)抑制脂多糖(LPS)诱导的血管炎症反应效应和分子机制。方法:将体外培养的血管环预先用ABL孵育后,再用LPS刺激,提取组织总蛋白进行Western blotting分析。结果:ABL抑制LPS诱导的IKK磷酸化活化和由此引发的IκBα的磷酸化降解,降低NF-κB水平,进而抑制NF-κB依赖的炎症因子iNOS、COX-2、ICAM-1和VCAM-1的表达。结论:ABL是一种调节NF-κB活性的制剂,具有抑制致炎因子表达,上调抑炎因子水平,维持两者平衡的作用,可消除LPS诱导的血管炎症反应。

旋覆花内酯对人血管内皮细胞环加氧酶2和细胞间粘附分子1表达的影响

目的观察旋覆花内酯对脂多糖诱导的人血管内皮细胞核因子κB激活及促炎基因环加氧酶2和细胞间粘附分子1表达的影响。方法 应用Western印迹检测血管内皮细胞间粘附分子1和细胞核中P6 5水平,以逆转录—聚合酶链反应技术检测环加氧酶2基因表达的活性。结果 12 .5、2 5和5 0 μmol/L的旋覆花内酯分别使脂多糖诱导的环加氧酶2mRNA表达水平降低35 .85 %、4 2 .4 6 %和5 3.4 6 % ;使细胞间粘附分子1的表达分别降低9.77%、4 0 .87%和4 6 .83%。旋覆花内酯能够拮抗脂多糖诱导的核因子κB亚单位P6 5核移位,用该化合物预处理细胞后再用脂多糖诱导时,细胞核内的P6 5水平不再升高。结论 旋覆花内酯通过抑制核因子κB的活化而抑制促炎基因环加氧酶2和细胞间粘附分子1在血管内皮细胞中的表达。

在线推扫富集-胶束电动毛细管色谱检测旋覆花素中和大鼠血浆中的旋覆花内酯

采用熔融石英毛细管,以含有50mm o l/L十二烷基硫酸钠的50mm o l/L硼酸盐缓冲液为电极缓冲液,以10mm o l/L硼酸盐缓冲液为上样缓冲液,经过对分离条件的优化,成功地建立了胶束电动毛细管色谱结合在线sw eep ing(推扫)富集技术检测中性脂溶性物质旋覆花内酯(acety lb ritann ilac tone,ABL)的实验方法。所建方法的批内、批间测定值的相对标准偏差均小于5%,灵敏度为0.005g/L,回收率大于92%;被检测样品的含量与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为0.997 5。用所建立的方法检测了旋覆花素中ABL的含量及其在体内的动态变化,结果表明胶束电动毛细管色谱结合在线sw eep ing样品富集技术可显著提高检测的灵敏度。该方法具有操作简单、进样量小(nL级)、检测速度快等特点,弥补了毛细管电泳在测定痕量组分方面的不足。

单乙酰大花旋覆花内酯衍生物研究

Five new 6-O-prolinated monoacetylbritannilactones have been synthesized from N-acetylprolyl chlorides with 4-N,N-dimethylaminopyridine as catalyst and characterized by elemental analysis, IR, 1H NMR, 1H-1H COSY and MS. The compound 3b displayed a good biological activity for human HL-60 cell in vitro（ED50=4.6 mg/L）.

HPLC-ELSD法测定不同产地欧亚旋覆花中1-O-乙酰旋覆花内酯的含量

目的:采用HPLC-ELSD方法测定不同产地欧亚旋覆花中1-O-乙酰旋覆花内酯的含量。方法:采用高效液相色谱法,蒸发光散射检测器。色谱柱:Diamonsil ODS C18(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温:30℃;流动相:乙腈-水梯度洗脱,流速:0.8ml.min-1;ELSD条件:漂移管温度:100℃,载气流速:2.8 L.min-1。结果:1-O-乙酰旋覆花内酯线性范围为2.72～19.00μg,平均回收率98.91%,RSD=2.20%(n=6)。结论:方法可靠,简单可行,为控制中药材欧亚旋覆花的质量提供了依据。

旋覆花内酯抑制血管平滑肌细胞炎性应答与阻断NF-κB活化有关

应用免疫细胞化学染色及Western印迹检测血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)环加氧酶-2(cyclo-oxygenase-2,COX-2)表达、NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)水平和NF-κBp65核转位的变化;电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)确定旋覆花内酯(1-o-acetylbritannilactone,ABL)对核内NF-κBp65与DNA调控元件的结合活性的影响。结果表明,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的VSMC,p65核转位加快,细胞核内的NF-κBp65水平快速升高,同时伴有IκB-α的减少;用ABL预处理VSMC后,LPS诱导的p65核转位增加及IκB-α减少受到明显抑制,抑制作用呈剂量依赖性。EMSA结果显示,LPS处理VSMC,其核蛋白与含有NF-κB结合位点的探针的结合活性升高;而用ABL预处理的VSMC,LPS诱导的核蛋白与探针结合活性的升高受到明显抑制。进而,ABL对NF-κB活化启动的下游炎性基因COX-2表达也具有较强的抑制效果。因此,ABL是一种抗炎物质,通过抑制NF-κB活化和炎性基因COX-2的表达而减弱或消除LPS诱导的VSMC炎症应答反应。

1,6-O,O-二酰基大花旋覆花内酯衍生物的合成及其抑制NO生成活性

以从旋覆花中提取分离得到的1-O-乙酰基大花旋覆花内酯(ABL)为原料,经酯化反应或还原反应制备了8个1,6-O,O-二酰基大花旋覆花内酯(OABL)衍生物(化合物1~8),并测定其对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞一氧化氮(NO)生成的抑制作用,评价其抗炎活性。结果表明,化合物5~8具有良好的抑制NO生成活性(IC_(50)<2μmol/L),其活性水平较先导化合物OABL显著提高。

旋覆花内酯抑制炎性因子介导的内皮细胞与单核细胞的黏附

为了观察旋覆花内酯(1-O-acetylbritannilactone,ABL)乙酰化衍生物ABLO2对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激的内皮细胞ECV304活化及其与RAW264.7单核/巨噬细胞相互作用的影响,采用Western印迹检测核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)活化以及NF-κB依赖的黏附分子的表达水平,应用电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检查ABLO2预处理及LPS/IFN-γ诱导对NF-κB与DNA结合活性的影响。结果显示,ABLO2显著抑制LPS/IFN-γ诱导的NF-κB核转位和DNA结合活性,同时ABLO2降低NF-κB抑制蛋白(IκB)激酶(IκBkinases,IKK)的活性,抑制IκB的磷酸化及降解;ABLO2还通过减少血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、基质金属蛋白酶-9(metalloproteinase-9,MMP-9)、黏蛋白-c(tenascin-c)的表达,进而减弱单核细胞与内皮细胞之间的黏附作用。研究结果表明,ABLO2通过抑制IKK活性及IκB降解而抑制NF-κB活化,进而起到抑制NF-κB依赖的黏附分子表达及细胞黏附作用。

欧亚旋覆花中1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的CO_2超临界正交优化萃取工艺研究

目的:考察CO2超临界萃取欧亚旋覆花中有效成分1-O-乙酰基大花旋覆花内酯(ABL)的影响因素,确定ABL最佳萃取工艺。方法:通过单因素考察,分别考察了原料粒度、CO2流速、萃取温度、萃取压力和萃取时间对干膏得率和ABL提取率的影响,并选取萃取温度、萃取压力和萃取时间3个因素,设计正交实验。结果:正交实验确定的最佳提取工艺是:萃取温度60℃、萃取压力20 MPa、萃取时间5 h,此条件下干膏得率为3.78%,ABL提取率为0.51%。结论:正交实验确定的最佳工艺条件下,验证实验和放大实验干膏得率和ABL提取率均优于系统分离法,实现了ABL选择性富集和快速高效萃取。

1-O-乙酰基大花旋覆花内酯及其衍生物的研究进展

1-O-乙酰基大花旋覆花内酯为倍半萜内酯类化合物,是中药旋覆花的活性成分之一,具有抗炎、抗肿瘤、抗菌等多种药理作用,近年来1-O-乙酰基大花旋覆花内酯类化合物的药理作用及其机制以及结构修饰得以较为深入的研究。此外,以该天然产物为原料,通过化学反应进行结构修饰的衍生物在细胞毒活性方面研究也取得了新的进展。本文综述了1-O-乙酰基大花旋覆花内酯及其衍生物的提取制备、含量测定、药理活性、作用机制和构效关系。

一氧乙酰旋覆花内酯对缺氧心肌细胞的作用研究

目的:探讨一氧乙酰旋覆花内酯(1-O-acetylbritannilactone,ABL)在心肌细胞缺氧损伤中的作用及其机制。方法:体外培养H9C2心肌细胞,构建缺氧损伤模型,分为对照组、缺氧组、1μmol/L ABL组和10μmol/L ABL组。采用CCK-8法检测心肌细胞活力,采用RT-PCR检测白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症指标及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶p67phox亚基、NADPH氧化酶gp91phox亚基、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等氧化应激相关指标的mRNA表达水平,采用活性氧检测试剂盒进行活性氧(ROS)水平检测,用缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2、细胞色素C(Cyt C)及核因子κB(NF-κB)p65、NF-κB抑制蛋白α(IKBα)的蛋白表达水平。结果:(1)不同浓度ABL对心肌细胞存活率的影响:1、2、5、10μmol/L的ABL均未影响心肌细胞存活率(P均>0.05)。(2)各组心肌细胞缺氧损伤后炎症因子的表达:与对照组相比,缺氧组细胞内IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的mRNA表达水平均明显升高(P均<0.05),ABL预处理后上述促炎性因子表达水平呈浓度依赖性降低(P均<0.05),但仍高于对照组(P均<0.05),且1μmol/L和10μmol/L ABL组组间差异有统计学意义(P均<0.05)。(3)各组心肌细胞缺氧损伤后氧化应激的变化:与对照组相比,缺氧组细胞ROS水平明显升高,p67phox、gp91phox的mRNA表达水平均明显升高,ABL预处理后上述改变呈浓度依赖性降低(P均<0.05);与对照组相比,缺氧组细胞SOD、GSH-Px的mRNA表达水平均明显降低(P均<0.05),ABL预处理后上述抗氧化物的表达呈浓度依赖性升高(P均<0.05)。(4)各组心肌细胞缺氧损伤后凋亡的变化:与对照组相比,缺氧组细胞凋亡率、Bax和Cyt C的蛋白表达水平均明显升高,Bcl-2的蛋白表达水平则明显降低(P均<0.05),ABL预处理后逆转了上述细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的改变(P均<0.05),且作用呈浓度依赖性(P均<0.05);(5)各组心肌细胞缺氧损伤后相关信号通路的变化:与对照组相比,缺氧组细胞的磷酸化p65、IKBα蛋白的表达水平均明显升高(P均<0.05),ABL预处理后上述蛋白表达水平呈浓度依赖性降低(P均<0.05)。结论:ABL可通过抑制NF-κB p65/IKBα信号通路对缺氧损伤的心肌细胞发挥保护性作用。

一氧乙酰旋覆花内酯对血管紧张素Ⅱ诱导的肥大心肌细胞的保护性作用

目的 探讨ABL在心肌细胞肥大中的作用及其机制。方法 体外培养H9C2心肌细胞,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)构建心肌细胞肥大模型;模型组给予1μmol/L AngⅡ刺激24h、ABL处理组给予AngⅡ刺激,同时给予5μmol/L和10μmol/L ABL处理24h。采用心肌细胞肌动蛋白α-actinin染色评价心肌细胞大小,采用RT-PCR检测肥厚相关基因心房利钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、肌球蛋白重链β(β-MHC)的表达;蛋白印迹(Western blot)法检测信号通路蛋白的表达。结果 与模型组比较,5μmol/L和10μmol/L ABL处理组心肌细胞面积明显降低(P<0.05);ANP、BNP、β-MHC肥厚相关基因表达降低(P<0.05),且其抗心肌细胞肥大呈现剂量依赖性(P<0.05)。Western blot法检测结果显示ABL处理组AMPKa磷酸化水平增高(P<0.05),而Akt、m TOR、GSK3β的磷酸化明显抑制(P<0.05);AMPKa拮抗剂Compound C可阻断ABL的心肌保护作用。结论 ABL可通过激活AMPKa信号通路,调节Akt/Mtor/GSK3β对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大发挥保护性作用。

HPLC法测定条叶旋覆花不同部位中线叶旋覆花内酯A的含量

目的利用HPLC法对7批不同产地金沸草基源植物之一条叶旋覆花的干燥地上部分中线叶旋覆花内酯A的含量进行测定,并与其在头状花序中的含量比较,为金沸草药材质量标准的制定及合理应用提供依据。方法Agilent Zorbax SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),在柱温为30℃、流速为1.2 ml/min下以乙腈-水为流动相梯度洗脱,检测波长为212 nm。结果实验结果符合《中华人民共和国药典》(2015版)方法学验证的要求,金沸草基源条叶旋复花的头状花序中线叶旋覆花内酯A的平均含量为0.732%,在干燥地上部分的平均含量为0.125%,仅为头状花序的1/7,差异显著。结论建立的质量控制方法简单易行,可为条叶旋覆花的质量控制及合理用药提供数据支持和科学依据。

大花旋覆花中的新倍半萜内酯

从大花旋覆花（ＩｎｕｌａｂｒｉｔａｎｎｉｃａＬ．ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）中分离得到了３个新倍半萜内酯化合物，应用波谱技术和化学方法确定了其结构。其中二乙酰基大花旋覆花内酯（１，６—Ｏ，Ｏ—ｄｉａｃｅｔｙｌｂｒｉｔａｎｎｉｌａｃｔｏｎｅ）显示有细胞毒活性。同时，从该植物中还得到了蒲公英醇、蒲公英醇乙酸酯、胡萝卜甙、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸甘油酯。

旋覆花中1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的分离分析及抑菌活性测定

为了明确菊科植物旋覆花中主要抑菌活性物质,对旋覆花花序粗提物氯仿萃取组分进行分离,得到化合物1-氧-乙酰大花旋覆花内酯(ABL),运用高效液相色谱法测定花序粗提物中化合物ABL的含量,并测定化合物ABL对黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、黄瓜灰霉病菌、番茄早疫病菌和致病疫霉等5种植物病原菌的抑菌活性。结果表明,化合物ABL对照品,经紫外光谱、红外光谱、核磁共振等确定结构,纯度为99.5%,符合中药化学对照品含量测定要求。运用高效液相色谱法测定旋覆花花序粗提物中ABL的含量为2.45%,进而计算得到旋覆花花序中ABL的含量约为0.25%。化合物ABL对5种植物病原真菌具有不同的抑菌活性,其中对致病疫霉休止孢萌发抑制作用最强,在浓度为0.1mg/mL时,抑制率可达100%。

生物源杀菌剂与化学杀菌剂协调防控黄瓜病害

本文研究枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BAB-1水剂、解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens SAB-1水剂、大花旋覆花内酯乳油与化学杀菌剂交替或混合使用对温室黄瓜病害发展的影响。寿光试验包括以下处理:交替或混合喷施50%啶酰菌胺WG、68.75%氟吡菌胺.霜霉威SC的桶混液、60%唑醚.代森联WG、40%嘧霉胺SC、50%烯酰吗啉WP、10%苯醚甲环唑WG、69%烯酰.锰锌WP、68.75%噁唑.锰锌WG、52.5%噁唑.霜脲氰WG等不同作用机理和防治谱的化学杀菌剂;混施生防菌剂BAB-1水剂、SAB-1水剂及68.75%氟吡菌胺.霜霉威SC、50%烯酰吗啉WP、25%双炔酰菌胺SC、25%吡唑醚菌酯EC等对霜霉病特效化学杀菌剂;将不同化学杀菌剂桶混液与BAB-1水剂、SAB-1水剂和化学杀菌剂桶混液交替喷施。其对黄瓜霜霉病的防效分别为94.5%、92.3%和93.6%,对黄瓜白粉病分别为90.7%、89.9%和90.4%,对灰霉病的防效分别为69.3%、85.6%和85.7%,每种病害的病害发展曲线下面积(AUDPC)相当。在定州试验中,化学杀菌剂与SAB-1混施对白粉病的防效(84%)明显高于其与BAB-1混施的防效(72.8%),对灰霉病的防效(61.3%)明显低于后者的防效(95.1%),与SAB-1、BAB-1混施后对白粉病、灰霉病及霜霉病防效分别为90.2%、89.3%和92.6%。在保定郊区试验中,将大花旋覆花内酯乳油与化学杀菌剂及BAB-1水剂、SAB-1水剂交替喷施显著降低霜霉病、白粉病及灰霉病的严重度及AUDPC,对其防效分别为83.5%、87.4%和88.5%,AUDPC分别为219、352和249,延缓了3种黄瓜病害的发展。

基于HPLC指纹图谱结合化学计量学的旋覆花药材质量评价研究

目的建立旋覆花药材的HPLC指纹图谱及同时测定绿原酸、咖啡酸、芦丁、花旗松素、1,5-O-二咖啡先奎宁酸、1-O-乙酰旋覆花内酯、槲皮素、狭叶依瓦菊素8个成分含量的方法,运用化学计量学对不同产地旋覆花药材进行质量评价。方法采用Dubhe C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱;体积流量1.0mL/min;检测波长205 nm;进样量10μL;柱温30℃。采用中药指纹图谱相似度评价软件进行相似度分析,结合主成分分析和偏最小二乘法判别分析寻找并分析7个产地旋覆花药材间的差异成分及其分布特点。结果建立了旋覆花药材的HPLC指纹图谱,相似度为0.88~0.98,标定共有峰20个,通过对照品比对指认出绿原酸、咖啡酸、芦丁、花旗松素、1,5-O-二咖啡先奎宁酸、1-O-乙酰旋覆花内酯、槲皮素、狭叶依瓦菊素8个共有峰,样品一致性良好。通过主成分分析将样品聚为4类,结合偏最小二乘法判别分析发现咖啡酸、绿原酸、1-O-乙酰旋覆花内酯等7个成分是造成样品差异性的主要标记性成分。含量测定结果表明:各产地8种成分总量江苏>甘肃>河南>浙江>河北>安徽>山东。结论首次建立了旋覆花药材HPLC指纹图谱及倍半萜类、黄酮类、酚酸类多成分含量测定的质量评价方法,操作简便、结果可靠,明确了不同产地旋覆花药材间成分的差异,为旋覆花药材的资源开发及利用提供依据。