旋转细胞培养系统对老年人表皮干细胞增殖和干性维持的影响

背景:由于人口老龄化和老年疾病的增加,对老年人表皮干细胞的研究和利用变得越来越重要。但由于老年人表皮干细胞的增殖和干性能力较弱,限制了其在生物医学和临床研究的应用。目的:探讨旋转细胞培养系统培养的老年人表皮干细胞的增殖和干性维持能力。方法:采用传统平面培养方法获取儿童(7-12岁)和老年人(60岁以上)表皮干细胞,经细胞形态学和细胞免疫荧光鉴定后,通过流式细胞术、CCK-8、细胞克隆形成实验分析儿童和老年人表皮干细胞增殖能力的差异;采用旋转细胞培养系统和3D TableTrix®微载体培养儿童和老年人表皮干细胞,通过活/死染色、细胞倍增效率、细胞倍增时间以及实时定量聚合酶链反应检测细胞增殖情况以及干性标志物的表达。结果与结论:①在平面培养条件下,儿童组表皮干细胞较老年组具有更强的增殖能力;②与平面培养相比,经旋转细胞培养系统动态培养的老年人表皮干细胞的细胞倍增效率更高(P<0.01),细胞倍增时间更短(P<0.01);③旋转细胞培养系统动态培养促使老年人表皮干细胞自组装形成基于微载体支架的三维细胞球,具有和儿童组表皮干细胞相似的增殖情况;④动态培养后的老年人表皮干细胞在干性标记物基因(ITGA6和ITGB1)、基底细胞标记物基因(K5)和分化标记物基因(K10和K1)表达上可达到和儿童组相近的表达水平。结果表明:旋转细胞培养系统动态培养不仅可以提高老年人表皮干细胞的培养效率,促进细胞增殖和自组装成三维细胞球,而且可维持老年人表皮干细胞一定的干性,未发生完全终末分化。

旋转微重力细胞培养系统下Indianhedgehogd转染兔BMSCs促进成软骨分化并抑制老化的实验研究

目的探讨模拟微重力环境下,Indianhedgehog(IHH)基因过表达对兔BMSCs成软骨分化的影响。方法取第2代兔BMSCs,分为旋转微重力细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)组和传统组2个大组,每个大组进一步分为3个亚组,即IHH基因腺病毒载体转染组(RCCS 1组和传统1组)、绿色荧光蛋白腺病毒载体转染组(RCCS 2组和传统2组)及空白对照组(RCCS 3组和传统3组)。RCCS组细胞均在模拟微重力环境下进行成软骨细胞诱导分化;常规组在6孔板中进行常规细胞培养及成软骨细胞诱导分化。诱导分化过程中,检测IHH蛋白表达(ELISA法)及ALP活性;实时荧光定量PCR检测软骨及软骨肥大相关基因表达;Wertern blot法检测Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖(aggrecan,ANCN)蛋白表达;并取细胞爬片行甲苯胺蓝染色及膜联蛋白V(Annexin V)-cy3免疫荧光染色观察。结果转染后荧光显微镜下RCCS 1、2组可见明显绿色荧光,转染效率约95%。ELISA检测示,RCCS及传统1组IHH蛋白均明显高于2、3组(P<0.05);传统1组各时间点ALP活性均高于传统2、3组(P<0.05),RCCS 1组ALP活性仅于诱导分化3、7 d稍高于RCCS 2、3组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测示,传统1组在诱导分化早期高表达Ⅱ型胶原、ANCN,但在后期高表达Ⅹ型胶原、ALP及AnnexinⅤ(P<0.05);RCCS1组在诱导分化各时期均高表达软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9,且低表达软骨肥大相关基因Ⅹ型胶原、ALP及AnnexinⅤ(P<0.05)。Wertern blot法检测示,诱导21 d时传统1组Ⅱ型胶原蛋白表达量明显低于传统2、3组(P<0.05);RCCS 1组各时间点Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达量均明显高于RCCS 2、3组(P<0.05)。甲苯胺蓝染色示,诱导21 d时传统1组染色浅于传统2、3组,RCCS 1组各时间点染色均明显深于RCCS 2、3组;Annexin V-cy3免疫荧光染色示,各时间点传统1组红色荧光均强于传统2、3组,RCCS各亚组红色荧光表达均较弱且组间无明显差异。结论在模拟微重力环境下,IHH基因转染BMSCs可有效促进软骨生成,并抑制软骨老化或向成骨发展,适合软骨组织工程的需要。

微重力旋转培养系统对骨髓间充质干细胞分化增殖的影响

目的:观察模拟微重力旋转培养系统(RCCS)对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外培养的影响。方法:将兔MSCs与三维载体PGA相复合后,置于RCCS系统中进行培养,观察MSCs增殖能力和超微结构的变化。结果:经过RCCS系统培养,MSCs增殖能力明显增强,细胞形态较静置培养组更接近生理情况。结论:采用RCCS系统进行细胞/载体结合物的体外培养,增殖能力有明显增强,细胞的形态更接近生理状态,有助于培养出接近正常软骨生物学特性的工程化软骨。

微重力旋转培养系统对脂肪干细胞分化增殖的影响

目的:观察模拟微重力旋转培养系统(RCCS)对脂肪干细胞(ADSCs)体外培养的影响。方法:将免ADSCs与三维载体PGA相复合后,置于RCCS系统中进行培养,观察ADSCs增殖能力和超微结构的变化。结果:经过RCCs系统的培养,AD- SCs增殖能力明显增强,细胞形态较静置培养组更接近生理情况。结论:采用RCCs系统进行细胞/载体结合物的体外培养,ADSCs增殖能力明显增强,细胞形态更接近生理情况,有助于培养出接近正常软骨生物力学特性的工程化软骨。

旋转细胞培养系统培养的山羊软骨细胞

目的探讨用旋转细胞培养系统(RCCS)进行大动物软骨细胞扩增的可行性。方法将单层培养的具有正常表型的中国山羊软骨细胞和Cytodex-3微载体放入RCCS的培养容器中,加入DMEM培养基进行培养。在细胞培养的第3、6、9、12天,于倒置显微镜下观察Cytodex-3微载体表面软骨细胞生长形态及增殖变化情况,并对收获的软骨细胞进行蕃红花“O”染色和Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色分析。结果软骨细胞贴附于微载体表面生长,细胞初期呈球形、半球形凸起,逐渐向周围伸展,随时间的延长,贴附于微载体的细胞逐渐增多。收获的软骨细胞蕃红花“O”染色呈强阳性,Ⅰ型胶原染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结论利用RCCS可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞,培养的软骨细胞具有正常的表型,能特异性分泌软骨组织特有的基质成分。

旋转式细胞培养系统的应用进展

细胞培养是生物学实验的基础,而在传统的平面培养方式中,细胞形态和生物学特性都发生了一定改变。旋转式细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)通过反应器的不断旋转,模拟微重力环境,从而在普通实验室内,实现体外细胞三维培养模型的建立,在干细胞培养方面,也有独特的优势。进一步利用旋转式细胞培养系统,将为细胞培养提供新的思路。

旋转式细胞培养系统的原理及应用

细胞培养在整个生物技术中起着非常重要的作用,在传统的细胞培养系统中,细菌类的细胞培养成活率高,但是哺乳细胞的培养过程却并不尽如人意。旋转式细胞培养系统通过反应器的不断旋转并模拟微重力环境,可以达到普通培养器皿不能达到的环境要求,因此在细胞培养方面,一直占有优势,为研究者培养新的细胞提供了新的思路。

香菇多糖对抗模拟微重力环境培养的淋巴细胞免疫功能抑制的实验研究

本研究旨在探索香菇多糖对抗旋转式细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)模拟微重力环境下淋巴细胞免疫功能降低的作用。体外分离培养小鼠脾淋巴细胞,在正常重力环境和RCCS模拟微重力环境下分别添加10、20和40μg/ml的香菇多糖溶液,培养24、48和72 h取样,用MTT法、ELISA和流式细胞术分别检测香菇多糖对细胞增殖度、细胞因子分泌量和表面标志表达的影响。结果表明,10、20和40μg/ml香菇多糖在处理时间内对小鼠脾淋巴细胞增殖无明显促进作用;不同浓度的香菇多糖均可提高小鼠脾淋巴细胞在模拟微重力环境下IL-2和IFN-γ的分泌量和促进小鼠脾淋巴细胞表面CD4和CD8分子的表达。结论:香菇多糖具有对抗模拟微重力环境造成的淋巴细胞免疫功能降低的作用。

RCCS模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞代谢组学的影响

目的探讨旋转式细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞代谢组学的影响。方法通过体外培养人胃黏膜上皮GES-1细胞,选取3~10代处于对数生长期细胞进行实验,随机分为模拟微重力组和正常重力组,细胞分组培养1、3、5 d,随后进行LC/MS非靶向代谢组学分析。应用正交偏最小二乘判别分析和两样本独立t检验,寻找2组细胞的差异代谢物;再将差异代谢物输入KEGG数据库,构建代谢通路并进行功能分析。结果2组GES-1细胞经RCCS培养1 d后有151种差异代谢物,其中113种表达上调,38种表达下调;RCCS培养3 d后有134种差异代谢物,其中109种上调,25种下调;RCCS培养5 d后有154种差异代谢物,其中131种表达上调,23种表达下调。通过Venn图筛选出2组1、3、5 d的共同差异代谢物(变量重要性>1且P<0.05)74种,其中57种表达上调,17种表达下调。KEGG数据库分析发现有具体名称及相关功能的差异代谢物44种,主要包括磷脂、氨基酸、辅助因子及羧酸,主要涉及脂类代谢、氨基酸代谢、辅酶和维生素代谢、神经递质代谢、碳水化合物代谢、细胞增殖和凋亡、肿瘤调控、膜转运和信号传导等信号通路。结论RCCS模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞的代谢产生明显影响,主要涉及脂类代谢和膜结构损害、细胞增殖凋亡及肿瘤调控。

HepG2细胞在模拟微重力条件下的生长研究——体外细胞三维生长模型构建

将人肝癌细胞(HepG2)接种于生物可降解支架聚羟基乙酸(polyglycolicacid,PGA)上,采用模拟微重力方法,在具有低剪应力和适宜气体扩散的旋转细胞培养系统(RCCS)中培养,构建体外三维培养模型.通过扫描电镜、透射电镜、RT-PCR、流式细胞术等方法观察分析.结果表明,细胞在此模型中生长良好,细胞呈多面体,含有丰富的微绒毛、线粒体以及胞间有紧密连接形成.该系统有利于细胞形成三维结构,更接近于体内细胞实际生长状况.另外,通过黏附分子表达分析,表明该模型重现了肝癌细胞某些体内侵袭转移特征.一些在肿瘤细胞侵袭和转移过程中具有重要作用的细胞黏附分子(celladhesionmolecules,CAMs)表达有了显著的变化,其中E-钙粘素(E-cadherin)表达降低,CD44、细胞间黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1,CD54)以及整合素β1(integrinβ1,CD29)表达增高.在体外实验中,对实验模型的适当选择是得到理想客观实验结果的必要前提,采用模拟微重力的方法构建的体外细胞三维培养模型,将为肿瘤生物学研究、药物敏感性试验等提供更为理想的研究模型.

RCCS模拟微重力对人角化细胞代谢组学的影响

目的探讨旋转式细胞培养系统(RCCS)模拟微重力对人永生化角质形成细胞系(HaCaT)细胞代谢组学的影响。方法应用RCCS建立模拟微重力细胞培养系统,体外培养HaCaT细胞,随机分为模拟微重力组(SMG组)和正常重力组(NG组),细胞培养1、2、3 d后收集样本,进行LC/MS代谢组学分析。结合正交偏最小二乘法(O-PLS-DA)和两样本独立t检验寻找两组细胞的差异代谢物,将差异代谢物输入KEGG数据库,进行代谢通路的构建与功能分析。结果 LC/MS代谢组学分析结果显示,与NG组比较,SMG组HaCaT细胞在RCCS模拟微重力环境中培养1 d后共有74种差异代谢物,其中16种表达上调,58种表达下调;2 d后共有89种差异代谢物,其中15种表达上调,74种表达下调;3 d后共有100种差异代谢物,其中23种表达上调,77种表达下调;以表达有统计学差异(VIP>1且P<0.05)的49种代谢物作为目标代谢标记物,其中鞘氨醇、谷氨酸、二十二碳五烯酸下调,脱水山梨糖醇等物质表达上调。KEGG分析显示,其涉及的代谢通路有氨基酸代谢、脂质代谢、细胞增殖和凋亡、物质转运、分解代谢、信号转导等。结论 RCCS模拟微重力环境可对角化细胞代谢产生明显影响,主要涉及鞘脂类、谷氨酸等代谢产物及相关信号通路。

模拟微重力对人牙髓干细胞在裸鼠体内矿化能力的影响

目的:研究模拟微重力环境对聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)在裸鼠体内矿化能力的影响。方法:分离、培养hDPSCs并进行鉴定,然后将hDPSCs接种到PLGA支架上培养72h后随机分为两组,普通重力组和模拟微重力组,经矿化诱导液培养1周后分别将细胞支架复合物移植到裸鼠体内,植入术后4周取材,进行组织学(HE和Vonkossa)和免疫组织化学(DSPP)检测。结果:HE染色均可见有血管生成,Vonkossa染色均为阳性,模拟微重力组DSPP的表达水平明显高于普通重力组(P<0.05)。结论:模拟微重力有利于hDPSCs在裸鼠体内的矿化。

模拟微重力条件HN13细胞的生长特点

目的:观察口腔鳞状细胞癌细胞HN13在模拟微重力条件下的形态学特点和生长情况,检测肿瘤细胞分化和侵袭相关基因的表达,并分析其生物学意义。方法:将HN13细胞接种于聚乳酸-羟基乙酸(poly lactic-co-glycolicacid,PLGA),应用旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)进行模拟微重力培养14d,光学倒置显微镜下观察细胞的形态,以实时定量PCR检测分析立体培养和平面培养细胞中,HIF1α、TGFβ1、VEGF-C、NF-κB和CCND1等基因的表达。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:细胞贴附于PLGA材料表面呈立体生长,表现为典型角化细胞形态,并形成类角化珠样结构,与口腔鳞状细胞癌细胞形态相似。HIF1α,TGFβ1和NF-κB表达降低(P<0.05),VEGF-C表达升高(P<0.05),CCND1表达无显著改变(P>0.05)。结论:模拟微重力条件下三维培养的细胞更接近体内细胞的真实形态,模拟微重力可作为构建体外细胞三维培养模型的方法。

RCCS中犬成骨细胞-nBGC复合物联合培养的实验研究

目的探讨联合应用成骨细胞、活性玻璃 /胶原纳米复合材料 (nBGC)和旋转式细胞培养系统 (RCCS)体外构建组织工程化骨的可行性。 方法采用骨片组织培养法 ,分离培养犬皮质骨成骨细胞 ,传代培养至第 2代后 ,利用浸泡接种方法 ,形成成骨细胞 -nBGC支架复合物 ,然后在RCCS中培养。扫描电镜观察和上清液分析了解nBGC支架上成骨细胞生长、胞外基质沉积和成骨表型维持的情况。 结果成骨细胞吸附于nBGC支架表面 ,表面可见颗粒状分泌物和丝状胶原纤维 ,形成三维结构的细胞外基质 ;上清液生化分析显示 ,成骨细胞分泌大量Ⅰ型胶原、骨特异性碱性磷酸酶 (B -AKP)和骨钙素 (OCN) ,且分别在 18、2 4和 30d达分泌高峰。 结论nBGC材料和RCCS可以为成骨细胞提供良好的生物学环境 。

灌注式RCCS生物反应器CFD模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响

目的:探讨利用微重力旋转细胞培养系统(RCCS)生物反应器仿真模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响。方法:联立不可压缩牛顿流体连续性方程和动量守恒方程、微载体内以及流动空间中氧的传递和反应方程,设置参数并求解;以Gamb it建立RCCS网格模型,并用F luent软件在欧拉多相模式下进行生物反应器数值模拟及流体力学分析。结果:以微载体直径及RCCS旋转速度作为自变量,基于欧拉-欧拉多相模型和氧运输公式成功建立RCCS数值分析模型。微载体直径和旋转速度均影响细胞培养效率,直径200、300、400μm的微载体旋转速度分别为10、12、14 r/m in;旋转1 h后直径600μm的微载体RCCS中间区平均氧浓度增加85%。结论:CFD可以定量模拟分析影响微载体及氧供的相关因素,为优化培养条件提供参数。

耳郭软骨细胞微载体的体外三维动态培养

背景:软骨细胞是软骨组织工程最常用的种子细胞,但是如何在体外扩增的同时又能维持其良好的软骨表型是研究的重点和难点之一。目的:通过微载体动态培养法,明确三维动态培养对耳郭软骨细胞增殖和分化的影响,为建立规模化扩增方法提供技术参考。方法:应用胰酶、胶原酶消化法分离、培养猪耳软骨细胞,并将获得的软骨细胞分为3组:培养皿单层培养、微载体三维静止培养和微载体三维动态培养。应用扫描电镜、荧光倒置显微镜、DIO荧光染色、冰冻切片DAPI染色观察细胞在微球上生长情况,DNA定量检测软骨细胞增殖能力,Real-time PCR检测软骨相关基因表达差异。结果与结论:①第1代软骨细胞可快速贴附于CultispherG多孔微载体表面,微载体动态培养组细胞数量多于微载体静止培养组,而且微载体动态培养组细胞分布更为均匀;②培养皿单层培养时,软骨细胞在4d时进入平台期,微载体动态培养组软骨细胞对数生长期延长为2-10 d,细胞数量在14 d达到高峰,微载体静止培养组细胞增殖速度缓慢;③在长期体外培养中,二维培养和微载体静止培养软骨表型丧失,而微载体三维动态培养在促进细胞增殖的同时,能够维持软骨表型;④结果表明,微载体联合旋转细胞培养系统三维动态培养可以作为耳郭软骨细胞规模化扩增的一种方法。

模拟微重力培养肝细胞的形态特点

目的 模拟微重力方法培养大鼠原代肝细胞 ,初步分析其形态学特点及其意义。方法 改良Seglen原位胶原酶灌注法获得大鼠肝脏单细胞悬液 ,2 .2× 10 5个 /ml加微载体Cytodex 3(4 g/L)接种 ,采用旋转细胞培养系统 (RCCS)进行模拟微重力培养。第 0、6、2 4、72、12 0、168小时取样 ,相差、体视显微镜观察活细胞形态 ,第 2 4小时标本苏木素 伊红 (HE)染色观察组织学形态 ,电镜观察超微结构。结果 模拟微重力培养中肝细胞 2 4h内贴附微载体并出现三维结构 ,2 4～ 72h发展为独特的肝细胞 微载体聚球体。电镜下可见细胞膜的 3种不同形态 ,其分布与功能相一致。结论 模拟微重力培养方法能使肝细胞形成分化的三维类组织结构 。

旋转系统下三维培养成纤维细胞-PGA复合物的实验研究

目的 观察微重力旋转培养系统对细胞种植于支架和细胞 支架复合物体外培养的影响。 方法 分离培养兔皮肤成纤维细胞 ,实验用第 2代细胞。 ( 1)分别用静止接种和动态接种方式 ,以 2× 10 6/cm3 的细胞密度接种于PGA网架 ,静止接种即滴加细胞悬液于PGA网架上 ,动态接种是把细胞悬液与PGA网架置于旋转细胞培养系统旋转接种 ,分别于 2、4、8、12、2 4h消化下网架上细胞后计数 ,通过计算细胞吸附率了解细胞吸附情况 ;( 2 )将相同细胞密度静止接种的细胞—PGA复合物分别置于旋转和静止条件下培养 ,于 1、3、5、7、14、2 1dMTT法检测细胞增殖 ;用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞生长、基质形成及其细胞与PGA纤维结合状况的变化。 结果 细胞吸附量随时间延长而逐渐升高 ,动态组在接种后 8、12、2 4h细胞吸附率显著高于静止接种组 ,分别为 ( 46 70 %±2 16 %)比 ( 31 5 0 %± 3 5 4%) ;( 5 6 36 %± 3 18%)比 ( 34 2 8%± 3 16 %) ;和 ( 6 6 32 %± 4 6 0 %)比( 37 38%± 4 6 6 %)。在 3周培养中旋转培养组细胞增殖快于静止组 ,而且细胞在网架中分布比静止组均匀 ,并伴有活跃的细胞基质分泌。 结论 旋转培养系统具有促进细胞吸附增殖分化和在支架内均匀分布的特点 。