无义介导的mRNA降解机制在肿瘤发生和治疗中的功能研究进展

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是广泛存在于真核生物细胞的转录后调控机制,可以识别并降解含有提前终止密码子(premature termination codons,PTC)的异常转录本,防止截短蛋白积累,同时NMD可以降解一些正常可以翻译为功能蛋白的mRNA分子,精准调控基因表达。NMD的生物学功能集中在细胞命运调控、细胞应激反应与动物胚胎发育等过程。本综述对无义介导的mRNA降解通路激活和抑制在肿瘤发生、发展和治疗中的功能及分子机制进行简要探讨。现有研究指出,NMD因子突变可导致人类多种肿瘤的发生。有意义的是,抑制NMD因子的表达,可以通过激活DNA损伤反应和抑制促癌因子的表达,起到杀灭癌症细胞的功效。本综述可为人类癌症发生的生物学机制和治疗策略提供新的思路。

终止密码子位点及无义突变介导的mRNA降解途径抑制对抗早发性无义突变药物atalruen通读效率的影响

目的探讨终止密码子上下文结构和无义突变介导的m RNA降解途径(NMD)抑制对抗早发性无义突变(PTC)药物atalruen通读效率的影响。方法利用聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法构建双荧光哺乳动物表达载体的早发性无义突变体p Ds Red-EGFPmtag-Y596X和p Ds Red-EGFPmtag-Y653X,转染哺乳动物细胞COS7,抗早发性无义突变药物atalruen,结合si RNA-upf1、放线菌酮(CHX)共同作用转染细胞,采用实时荧光定量PCR反应检测突变体上红色荧光蛋白(Ds Red)和绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,测定通读效率。结果PTC突变体p Ds Red-EGFPmtag-Y653X对atalruen的促通读敏感性显著大于p Ds Red-EGFPmtag-Y596X;si RNAupf1和CHX抑制NMD对atalruen的促通读效率没有显著影响。结论 PTC位点的+4位核苷酸对于atalruen的促通读效率十分关键,该位置是胞嘧啶(C)的突变体敏感性要显著大于腺嘌呤(A);atalruen与常见促通读氨基糖苷类药物不同,不能协同NMD途径的抑制来促进早发性无义突变的通读。

无义介导的mRNA降解与肿瘤

无义介导的mRNA降解(nonsense-m ed iated mRNA decay,NMD)能够选择性降解含有翻译提前终止密码子(prem ature translation term ination condon,PTC)的mRNA,从而防止对机体有害的截短蛋白(truncated pro-te ins)的产生,它是真核生物中广泛存在的一种高度保守的有效的监督机制。NMD与肿瘤发生发展过程中的基因突变有密切关系。

真核细胞中无义介导的mRNA降解

无义介导的mRNA降解(NMD)作为一种有效的细胞监控机制,主要监测细胞转录产物的提前终止密码子(PTC),并使得含有PTC的mRNA被迅速降解,从而防止其被翻译成为缺陷性的蛋白质。尽管NMD具有一定的保守性,但在酵母、哺乳动物以及后来的果蝇细胞中都发现有所不同。目前对于NMD的研究已进入了结构领域并发现它与端粒调控和RNAi等机制相互关联。

选择性剪接与无义介导的mRNA降解机制研究进展

mRNA的选择性剪接(alternative splicing,AS)是基因转录后的重要调节机制,也是增加蛋白质种类和数量,使有限的基因表达出更多蛋白质的主要机制。无义介导的m RNA降解(nonsense mediated m RNA decay,NMD)机制是一种存在于细胞内的m RNA监控机制,能检测并快速降解突变的m RNA。研究表明AS常与NMD机制相偶联,当某种基因表达异常升高时,通过AS产生可以被NMD降解的m RNA剪接异构体而下调该基因的表达,从而使基因表达维持在正常范围。AS和NMD机制的异常与人类多种遗传病和癌症的发生机制密切相关。故综述选择性剪接与无义介导的m RNA降解机制的机理及研究进展。

无义介导的mRNA降解机制及其在单基因遗传病中的作用

无义介导的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是一种广泛存在于真核生物细胞中的mRNA质量监控机制。该机制通过识别和降解含有提前终止密码子(Premature translational-termination codon,PTC)的转录产物防止有潜在毒性的截短蛋白的产生。据估计,约1/3的遗传性疾病是由提前终止密码子引起的,而NMD作用通常会改变某些遗传病的临床症状或遗传方式。文章主要综述了人体细胞中NMD对底物的识别及其作用机制,并以几种单基因遗传病为例探讨其对这些疾病表型的影响,表明NMD作用机制的进一步揭示将有助于单基因遗传病发病机制的阐明及治疗方法的改进。

SMG1-UPF1-eRF1-eRF3复合体参与贾第虫无义介导的mRNA降解激活

无义介导的mRNA降解(NMD)是一种重要的真核生物mRNA质量监控途径。NMD可识别并降解含有提前终止密码子(PTC)的异常mRNA(PTC-mRNA)。但NMD途径对PTC-mRNA的识别和降解机制尚无阐明。蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)是一种寄生性的原生动物,进化上处于真核生物基部,对其NMD途径的研究有利于了解NMD途径的机制与进化。本研究通过双分子荧光互补实验、酵母双杂交实验和体外pull-down实验,分析了贾第虫的UPF1(GlUPF1)、SMG1(GlSMG1)和肽链释放因子(GleRF1、GleRF3)之间的相互作用关系。结果表明,贾第虫的肽链释放因子都能够与GlUPF1发生相互作用,且GlUPF1的CH结构域与GleRF3能够形成较稳定的复合体,而GlSMG1的激酶结构域PIKK能与UPF1的C端和N端结构域相互作用。进一步研究证实,GlSMG1的PIKK结构域能使GlUPF1两种截短体GlUPF1(1~500 aa)和GlUPF1(501~1 304 aa)发生磷酸化修饰,说明GlUPF1的N端和C端均有GlSMG1的磷酸化位点。进一步分析证实,T111是GlUPF1上的1个磷酸化位点。我们的研究结果表明,贾第虫NMD途径起始阶段,首先在mRNA的PTC处的核糖体上形成SMG1-UPF1-eRF1-eRF3(SURF)复合体,并且GlSMG1磷酸化修饰GlUPF1,由此激活NMD途径,可能招募XRN1和SKI7d等酶参与无义mRNA的降解。

关于强心苷类药物与无义介导的mRNA降解在抗肿瘤作用中的研究

强心苷是一类具有强心作用的甾体苷类化合物,其可抑制心肌细胞膜上的Na^+/K^+ATP酶,通过降低质膜两侧Na^+的浓度差以减小Na^+-Ca^(2+)交换的驱动力,使胞质内Ca^(2+)浓度增加,从而产生强心效应。强心苷与细胞膜上Na^+/K^+ATP酶特异性结合,一方面可抑制其离子通道作用,另一方面在较低浓度下可调控下游信号通路,近来研究表明,其可能具有抗肿瘤效应。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是近年发现的RNA监控机制,被认为与肿瘤的发生发展有关。本文旨在探讨强心苷、NMD与肿瘤之间的相互关系,为肿瘤的治疗提供新思路。

mRNA的无义介导降解

无义介导的mRNA衰变(NMD)选择性地迅速降解含有提前终止密码子的mRNA,保护机体免于截短蛋白质产生的有害效应,是真核细胞广泛存在的保守的mRNA监视机制,有重要生物学意义。关于其基本机制目前提出了一些模型。

一种新的Srrm1/SRm160可变剪接体经历无义突变介导的mRNA降解

目的:研究基因Srrm1/SRm160的可变剪接。方法:应用RT-PCR研究Srrm1/SRm160的可变剪接,通过蛋白质的翻译抑制和RNA干扰研究剪接异构体是否经历无义突变介导的mRNA降解(NMD)过程。结果:获得Srrm1/SRm160新的可变剪接异构体,该异构体产生提前终止密码子,翻译抑制和RNA干扰证实含有提前终止密码子的剪接体经过NMD而降解。结论:Srrm1/SRm160通过可变剪接和NMD调节自身的表达水平,作为剪接因子进一步调节其他基因的可变剪接。

八肋游仆虫中无义介导的mRNA降解途径因子的细胞共定位研究

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是一种mRNA质量监控机制,识别和降解含有提前终止密码子(premature termination codons, PTCs)的异常转录本,以保障基因的准确表达。到目前为止,有报道的从高等哺乳动物到果蝇、线虫、酵母和原生动物中,均有NMD调控途径,但其机制模型存在一定的差异。由于原生动物在生物的起源与进化上的特殊地位,以及所含的调控因子相对简单,在各种分子机制的研究领域成为热点材料。本文以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)作为研究对象,从八肋游仆虫大核基因组数据库中,经过同源序列比对,分析鉴定到参与NMD途径的相关因子,包括无义mRNA识别因子poly(A)结合蛋白(poly(A) binding protein, PABP);启动NMD途径的核心因子上游移码蛋白1(up-frameshift 1, UPF1)和上游移码蛋白2(up-frameshift 2, UPF2);外显子连接复合体(exon junction complex, EJC)组分因子MAGO(Mago nashi)、Y14(Tsunagi或RMB8)、eIF4AIII(eukaryotic initiation factor 4A3)和UAP56(U2AF56 associated protein 56);降解无义mRNA的相关因子外切体(exosome)、脱帽酶(decapping mRNA 2, DCP2)、外切酶(5′-3′exoribonuclease 1, XRN1)和去腺苷酸化酶(PGK promoter directed over production, POP2)。其中,后3种蛋白质是mRNA加工小体(processing body, P-Body)的组分。通过荧光共定位分析,分别依次证实UPF1与UPF2之间、EJC组分因子之间和P-body组分因子之间的相互作用关系。随后,通过UPF2分别与MAGO和Y14的荧光共定位结果,推测八肋游仆虫依赖于EJC的NMD途径模型。通过UPF1分别与DCP2和外切体(exosome)的荧光共定位结果,推测了八肋游仆虫无义mRNA的两种降解方式:一种是无义mRNA被介导到P-body中分别被DCP2和POP2脱去5′端帽和3′端Poly(A)尾,随后在XRN1的作用下,沿着5′→3′的方向降解;另一种是在胞质中,无义mRNA直接通过招募POP2去腺苷酸化,随后又在招募来的外切体作用下,沿着3′→5′的方向降解。

蓝氏贾第虫无义mRNA的降解

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作为细胞内的一种重要的mRNA质量监控机制,可以降解含有提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的异常转录本,从而避免截短蛋白质对细胞的毒害,但其详细的分子机制有待进一步阐释。蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)作为一种寄生性单细胞原生动物,进化地位特殊,对其NMD途径的研究有利于阐明基因表达调控的分子和进化机制。本研究通过酵母双杂交及体外pull-down实验分析了贾第虫NMD途径因子上游移码蛋白1 (Giardia lamblia up-frameshift 1,Gl UPF1)、贾第虫RNA结合蛋白(Giardia lamblia HRP1,Gl HRP1)、贾第虫核糖核酸外切酶(Giardia lamblia Ski7p,Gl Ski7p、Giardia lamblia XRN1,Gl XRN1)之间的相互作用关系。结果表明,Gl UPF1全长与Gl HRP1、Gl XRN1(1～500aa)、Gl Ski7p间均可发生相互作用。而且Gl UPF1的CH结构域和C端结构域分别与Gl HRP1、Gl XRN1(1～500 aa)、Gl Ski7p相互作用。说明Gl UPF1在贾第虫NMD途径中作为招募平台,在无义mRNA识别和降解过程中发挥重要作用。为此,结合本实验室之前的研究结果,我们提出原生动物贾第虫的NMD途径:在提前终止密码子处SURF(SMG1-UPF1-eRF1-eRF3)复合物形成后,Gl UPF1被磷脂酰肌醇3-激酶(suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1,SMG1)磷酸化修饰,NMD途径激活,随后Gl UPF1与HRP1相互作用,将转录本标记为NMD底物; Gl UPF1进而招募下游贾第虫5'-3'核糖核酸降解酶Gl XRN1、贾第虫3'-5'核糖核酸降解因子Gl Ski7p,最终降解靶标mRNA。

NMD机制及其对人类遗传病的治疗意义

无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是真核细胞内重要的RNA质量监控机制,能够识别并降解含有提前终止子(premature termination codon,PTC)的mRNA,避免细胞内积累有害的截短蛋白质产物。同时,NMD机制还调控着大量不含PTC的mRNA稳定性,影响其蛋白质产物的含量。现综述了NMD机制的底物、调控因子及其对人类遗传病治疗意义的最新研究进展。

NMD途径功能缺陷对水稻表型及转录组的影响

无义介导的m RNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是细胞内一种关键的RNA质量控制途径,能够有效的降解细胞内错误的m RNA,以保持细胞内部环境的稳定与健康。本研究通过CRISPR/Cas9及amiRNA技术获得水稻NMD途径相关基因UPF1、UPF1-like、UPF2、UPF3的敲除或敲低型突变体,结合转录组测序和表型观察,探究NMD途径缺陷对水稻基因表达及可变剪接(alternative splicing,AS)的影响。研究结果表明,NMD途径为水稻正常生长所必需,部分缺陷也会造成株高、花粉活力等表型不同程度的变化。对基因表达的分析显示,NMD途径缺陷影响的基因大多表达上调,且ko-upf1-like和kd-upf1对基因表达的影响大于kd-upf2和kd-upf3。具体而言,NMD途径缺陷在水稻中引发了防御反应相关基因表达量的上升及次生代谢相关基因表达量的下降,且在60天龄早衰突变体中影响的基因更为广泛。转录组分析显示,不同的NMD途径相关基因缺陷均改变了数百个可变剪接,这些存在差异可变剪接的基因多与可变剪接调控通路相关,约有一半在不同突变体中共享,且大量富集了NMD靶标的特征。NMD途径能够通过影响可变剪接形式,改变转录本丰度等多种形式,调控防御反应和衰老等通路基因的表达,在水稻维持正常生理功能的过程中有着重要作用。

无义突变与“遗传补偿效应”

"遗传补偿效应"(genetic compensation response, GCR)是近年来在斑马鱼(Danio rerio)中最先描述的一个遗传现象,是指当敲低某一个基因时有明显的表型,但此基因的敲除遗传突变体由于其他基因的上调反而没有表型。这种基因敲低和敲除表型上的差异并非斑马鱼所独有,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小鼠(Mus musculus)等模式生物中都观察到此种现象。这种奇怪的现象一直困扰着基因功能研究。2019年4月3日,Nature同时在线发表两篇论文揭示了其中的奥秘,其中一篇来自于本实验室,另一篇来自于德国Stainier实验室。利用斑马鱼或小鼠培养细胞的不同基因的遗传突变体为模型,两个实验室分别证明无义突变与核酸序列同源性是激活遗传补偿效应的两个先决条件;无义mRNA介导的降解途径参与激活遗传补偿效应;同时还观察到补偿基因的高表达与其转录起始位点处的组蛋白H3K4me3修饰相关。本文具体介绍了这两篇研究论文中提出的"遗传补偿效应"分子机制的异同,以期为克服遗传补偿效应给基因功能研究带来的障碍提供新的思路和方法。

真核生物无义介导的mRNA降解与肿瘤关系的研究进展

研究发现任何错误剪接、移码、插入等基因突变都可能引入含有提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的转录产物,将导致翻译提前终止而产生无生物活性甚至毒害性截短蛋白(truncated proteins)。而无义介导的mRNA的降解(nonsensemediated m RNA decay,NMD)作用机制在基因转录及转录后加工过程中选择性地迅速降解含有提前终止密码子的mRNA,避免产生对细胞正常生理功能有害的截短蛋白,真核生物NMD是转录后m RNA监控的重要环节。肿瘤的发生发展与相应基因的表达有关,NMD可以降解含有PTC的mRNA,学者们认为抑制NMD后肿瘤中某些基因的表达上调,而上调的基因或许在肿瘤的发生发展中其抑癌基因的作用,故学者们抑制肿瘤中NMD后进行测序筛选发生无义突变的抑癌基因。

真核生物细胞中的无义介导mRNA降解机制

真核生物细胞具有不同的机制用于监视转录本的准确性以保证翻译产物的完整性与正确性 ,无义介导mRNA降解 (NMD)的作用对象主要是由于编码氨基酸的密码子突变为终止密码子 ,而使翻译提前终止的无义mRNA ,其降解方式是直接进行 5′端脱帽和 5′→ 3′方向的水解。

无义介导的mRNA降解在胚胎发育中的作用及机制的研究进展

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)最初被认为是一种广泛存在的mRNA质量监控机制,可迅速降解含有提前终止密码子的异常mRNA,避免有害的、截短的蛋白产物积累而对细胞造成损害。最近研究显示,NMD也可以调控执行重要细胞生理功能的正常基因转录物的降解过程,因此被认为是真核生物中高度保守的转录后调节机制。NMD直接或间接调控从酵母到人的3%～20%的转录组,对于细胞稳态、应激反应、增殖、分化等多种生理活动都是必不可少的。研究表明,NMD可以调节与发育相关的转录物的水平,NMD因子敲除大多具有胚胎致死效应。NMD在胚胎干细胞的自我更新、分化与胚胎发育的过程中发挥重要作用。本文将对NMD在胚胎发育中的作用及机制的最新研究进展进行综述,以期为胚胎发育的研究和胚胎发育相关疾病的治疗提供新的思路。

NMD作用的顺式调控元件

真核生物利用无义介导的mRNA降解 (nonsense mediatedmRNAdecay ,NMD) ,对含有提前终止密码子(prematureterminationcodons ,PTC)的异常转录产物进行快速清除 ,防止毒害性截短蛋白 (truncatedproteins)的产生 ,是真核生物重要的mRNA监视机制。NMD作用的启动与多种顺式调控元件有关 ,它们包括 :提前终止密码子的标识 ;PTC下游特定位置的序列元件 ,在酵母细胞称为DSE (downstreamsequenceelement,DSE) ,在哺乳动物细胞主要为内含子剪接依赖性序列元件 (exon exonjunction ,EEJ) ;稳定作用元件 (stabilizerelements ,STE)对NMD作用的阻抑调节 ;以及其他与NMD作用相关的序列 ,如 poly(A)延长、5′ UTR的uORF(upstreamopenreadingframe ,uORF)和程序化核糖体移码 (programmed 1ribosomalframeshift, 1PRF)信号序列等。

PTC下游翻译重启导致NMD途径的逃逸

无义突变介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）途径是真核生物体内一种重要的mRNA监督质控机制,它降解含有由无义突变、错误剪接、移码突变等产生的提前终止翻译密码子（premature translation termination codon,PTC）的mRNA,从而防止这种mRNA翻译产生的截短型蛋白质对机体造成的伤害.研究发现,一些含有PTC的mRNA发生了NMD途径逃逸,但具体机制仍不清楚.本研究将成视网膜细胞瘤基因1（retinoblastoma gene 1,RB1）作为NMD途径的靶基因,构建mini-RB1基因,包括外显子1-14（cDNA）、内含子14-外显子15-内含子15和外显子16-27（cDNA）的三部分序列,将其构建到真核表达载体pcDNA 3.1（-）中.根据人类基因组突变数据库选择3个突变位点W99X、G310X和R467X,构建相应无义突变体.分别将mini-RB1基因野生型和无义突变体转入HeLa细胞进行表达.用qRT-PCR检测发现,W99X无义突变体与野生型相比mRNA的水平无显著差异.为了进一步证实mini-RB1（W99X）发生了NMD逃逸,利用NMD途径抑制剂放线菌酮和转录抑制剂放线菌素D,分别处理转入野生型的mini-RB1基因及其无义突变体mini-RB1（W99X）的哺乳动物细胞,发现mini-RB1基因无义突变体的mRNA水平与野生型无明显差异,说明含有W99X无义突变的mini-RB1基因的mRNA发生了NMD逃逸.Western印迹检测mini-RB1基因的蛋白质表达发现,在无义突变位点W99X下游重新起始了蛋白质的翻译,因此,PTC下游蛋白质翻译的重新起始可能是导致无义mRNA逃逸NMD途径监控的主要原因.