无创染色体筛查技术在体外受精-胚胎移植中的初步研究和临床应用

目的探讨应用无创染色体筛查(NICS)技术检测囊胚培养液中的游离染色体和应用胚胎活检技术检测胚胎染色体的一致性,以初步确定NICS的临床应用价值。方法收集2016年3-12月在该院行卵胞浆内单精子注射—胚胎移植(ICSI-ET)的患者15例,分为A组(子宫及子宫附件无异常)、B组(多囊卵巢综合征)、C组(子宫内膜异位症);获得的23枚囊胚分为新鲜胚胎组和卵裂期解冻胚胎组; NICS筛查作为观察组,胚胎植入前遗传学筛查(PGS)作为对照组,比较二者的一致性。通过对14例有不良妊娠史的不孕不育患者行NICS胚胎筛选,初步确定NICS的临床应用价值。结果观察组与对照组的吻合率为82. 61%,一致性检验Kappa值为0. 65,两者一致性一般。新鲜胚胎组与卵裂期解冻胚胎组的吻合率分别为84. 62%和80. 00%,两组Kappa值分别为0. 69和0. 58,提示两组的一致性均一般。A、B、C 3组的吻合率分别为87. 50%、80. 00%和80. 00%,3组的Kappa值分别为0. 83、0. 58和0. 54,提示A组一致性较好,B、C组一致性一般。14例有不良妊娠史的不孕不育患者中有7例正常妊娠,孕19周进行胎儿羊水染色体检测,确认NICS检测结果准确。结论不同病症的不孕不育患者、不同来源的胚胎NICS和PGS检测结果无差别。NICS和PGS具有同样的准确性和可靠性。但NICS可能具有比PGS更广泛的应用前景。

无创胚胎染色体筛查在染色体非整倍体检测中的应用效果

目的探讨无创胚胎染色体筛查技术(NICS)在染色体非整倍体检测中的应用效果。方法收集2017年5月至2019年5月在安徽省妇幼保健院生殖中心拟行体外受精-胚胎移植的364例患者的囊胚培养液,并行NICS筛查。对单囊胚移植且临床确认妊娠的46例患者,根据其妊娠结局不同行不同染色体检查方法:对12例流产的患者行流产组织染色体检查,并以该检查结果为金标准,计算NICS的灵敏度和特异度;对继续妊娠的34例患者行外周血无创产前遗传学筛查(NIPS),比较NICS结果与NIPS筛查结果的差异。结果12例流产的患者样本中,流产组织染色体检查与NICS检查为染色体非整倍体者均为3例,NICS筛查的灵敏度为100%;在流产组织染色体检查为整倍体的9例样本中,对应的NICS检出2例为非整倍体,其特异度为77.78%,两种筛查方法的一致性分析Kappa值为0.64。继续妊娠的34例患者样本中,NIPS筛查均未检出13、18、21号染色体为非整倍体胚胎,NICS对这3条染色体的筛查结果与NIPS一致。结论NICS筛查染色体非整倍体有较好的灵敏度,但假阳性率偏高,需进一步技术优化以提高特异性。

无创胚胎染色体筛查技术对军队不孕不育夫妇助孕结局的影响

目的探讨无创胚胎染色体筛查技术(NICS)对军队不孕不育夫妇辅助生殖结局的影响。方法选择自2017年5月至2020年10月接受辅助生殖技术治疗的455对官兵夫妇进行前瞻性观察研究,其中133对实施卵母细胞胞浆内单精子注射(ICSI)方案,根据患者夫妇意愿进行分组,愿意接受NICS治疗45例,拒绝NICS治疗88例。88例中取消鲜胚移植后行单囊胚解冻复苏移植者26例,比较该26例(ICSI组)与NICS检测后首次单囊胚冻胚复苏移植39例(NICS组)的官兵夫妇取卵周期特征及复苏周期临床结局。结果NICS组患者男方年龄、女方年龄均较ICSI组高[男方年龄(35.79±4.52)岁vs(31.69±3.10)岁,女方年龄(34.45±4.0)岁vs(29.65±2.04)岁,均P<0.001],NICS组较ICSI组抗苗勒管激素(AMH)[(3.39±2.59)ng/mL vs(5.23±3.27)ng/mL]、hCG日卵泡数(13.68±7.12 vs 17.77±8.88)、获卵数(12.37±6.72 vs 17.38±10.63)、成熟卵子数(10.95±6.21 vs 15.15±9.46)均显著降低(均P<0.05)。NICS组与ICSI组FET临床妊娠率相当(82.1%vs 80.8%)。结论军队不育夫妇实施ICSI治疗,胚胎植入前行NICS检测优选胚胎移植可改善临床结局。

无创胚胎染色体筛查在男性严重少弱畸精子症不育患者的临床应用

目的:探讨无创胚胎染色体筛查技术(NICS)对男性严重少弱畸精子症辅助生殖妊娠结局的应用价值。方法:随机选取2017年1月至2020年12月因男方严重少弱畸形精症行辅助生殖助孕的男性不育患者共计170例,接受NICS治疗的85对夫妻作为试验组,接受卵胞质内单精子注射(ICSI)85对夫妇作为对照组,比较两组女方年龄、女方体重质量指数(BMI)、抗苗勒氏管激素(AMH)、基础窦卵泡计数(AFC)、不孕年限、男方年龄、精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率、精子DNA碎片化指数(DFI)、获卵数、正常受精数、优质囊胚数、临床妊娠率、流产率的差异。结果:NICS组与ICSI组相比,女方年龄、女方BMI、AMH、AFC、不孕年限、男方年龄、精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率、精子DFI、获卵数、正常受精数、优质囊胚数均无统计学差异(P均>0.05),NICS组明确诊断率88.24%,检测胚胎染色体整倍体率48.56%,NICS组挑选整倍体胚胎移植后临床妊娠率高于ICSI组(66.28%vs 51.09%)、而流产率低于ICSI对照组(12.28%vs 29.79%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:对于男性严重少弱畸形精子症不育患者,NICS技术可以提高临床妊娠率、降低流产风险。

无创胚胎染色体筛查技术对单囊胚冻胚复苏移植临床结局的影响

目的探讨无创胚胎染色体筛查技术(NICS)对单囊胚冻胚复苏移植临床结局的影响。方法回顾性分析372例行体外受精-单囊胚冻胚复苏移植病例的临床资料(移植前所有囊胚形态学质量经Gardner囊胚评分法评估均为优质囊胚)。其中,75例愿意接受NICS检测并且检测结果显示囊胚染色体拷贝数正常(A组),73例愿意接受NICS检测但检测结果显示囊胚染色体拷贝数异常(予剔除),其余224例未接受NICS检测(B组)。比较两组的临床结局。结果经NICS检测的148枚形态学优质囊胚中,75枚囊胚的染色体拷贝数正常,其余73枚囊胚的染色体拷贝数异常。A组的新生儿畸形率低于B组,而活产率高于B组(均P<0.05),但两组之间的临床妊娠率、持续妊娠率、早期流产率、异位妊娠率差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论与单纯传统囊胚评分比较,联合应用NICS技术检测胚胎染色体,能改善单囊胚冻胚复苏移植的活产率,降低新生儿畸形率。

胚胎培养液用于染色体筛查的初步研究

目的:对胚胎培养液筛查胚胎染色体进行初步探讨,为优质胚胎无创筛查体系提供数据和技术支持。方法:采集胚胎培养液86例和囊胚36例,其中56例为卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)胚胎培养液,30例为体外受精-胚胎移植(IVF-ET)胚胎培养液。采用基因测序通用文库试剂盒对囊胚及胚胎培养液进行MALBAC单细胞全基因组扩增及文库构建,运用高通量测序平台进行测序,运用ChromGoTM2.0数据分析平台检测染色体非整倍体及10M以上的片段缺失和(或)重复。结果:86例胚胎培养液中27例未检出染色体核型,其中前期收集36例标本,检出成功率41.7%;改进方法收集50例标本,检出成功率88.0%。对36例囊胚及其培养液染色体结果进行对比,IVF-ET 18例,染色体倍性一致率38.9%,非整倍体假阳性率50.0%,假阴性率0.0%;ICSI-ET 18例,染色体倍性一致率77.8%,非整倍体的假阳性率16.7%,假阴性率5.6%。结论:ICSI-ET受精方式在胚胎培养液用于胚胎染色体的筛查中优于IVF-ET;建立完善的培养液收集流程利于胚胎染色体检测。

无创胚胎染色体筛查技术在单囊胚冻胚复苏移植中的应用价值及其活产结局的因素分析

目的:探讨无创胚胎染色体筛查技术(NICS)在单囊胚冻胚复苏移植中的应用价值,分析影响活产结局的因素。方法:回顾性分析2019年1月至2021年12月我院收治的197例行单囊胚冻胚复苏移植患者的临床资料,53例行NICS检查且检测结果提示囊胚染色体拷贝数正常(NICS组),26例NICS检测结果异常予以排除,118例未接受NICS检测(非NICS组)。收集临床资料并追踪妊娠结局,根据妊娠结局将患者分为活产组(75例)和非活产组(96例),采用单因素及多因素Logistic回归分析影响单囊胚冻胚复苏移植活产的因素。结果:NICS组活产率高于非NICS组(P<0.05)。单因素分析显示活产组女方年龄小于非活产组(P<0.05),基础卵泡雌激素(FSH)水平、常规试管婴儿(IVF)周期≥2个低于非活产组(P<0.05),优质胚胎数、移植日子宫内膜厚度和NICS检查比例、发育成囊胚时间为D5比例高于非活产组(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示女方年龄偏大、发育成囊胚时间为D6是影响单囊胚冻胚复苏移植活产的危险因素(P<0.05),NICS检查是其保护因素(P<0.05)。结论:NICS筛查胎儿染色体异常可提高单囊胚冻胚复苏移植活产率,产妇高龄和囊胚发育速度过慢是影响活产的主要危险因素。在单囊胚冻胚复苏移植前有必要进行NICS检查,并尽量选择D5囊胚以提高活产率。

囊胚培养液中游离DNA的重要染色体整倍性研究

目的探讨利用培养液中游离DNA检测对应囊胚的13、15、16、18、21、22号染色体整倍性的效率。方法本研究共纳入239枚囊胚,所有的胚胎均来源于PGT-A周期。囊胚活检的滋养层细胞采用SNP芯片检测胚胎的整倍性;培养液游离DNA采用无创胚胎染色体筛查(NICS)方法检测整倍性;采用盲法比较两者的结果。计算NICS在检测13、15、16、18、21、22号染色体整倍性的敏感性、特异性、诊断效率、阳性预测值和阴性预测值。结果239枚囊胚中的209枚有NICS结果,NICS检出率为87.5%(209/239)。NICS方法在检测13、15、16、18、21、22号染色体的特异性、效率比较高,均>90%,NICS结果的阴性预测值超过97%;但是敏感性波动较大(33%~100%),阳性预测值较低(<50%)。结论NICS方法可以检测囊胚整倍性。当NICS结果显示这些重要染色体(13、15、16、18、21、22号染色体)为整倍体时,对应囊胚该条染色体整倍性几率高;但是当NICS结果显示这些重要染色体为非整倍体时,对应胚胎并不一定为非整倍体。

NICS与PGD检测胚胎染色体罗氏易位一致性的研究

目的探讨无创胚胎染色体筛查技术(NICS)与植入前遗传学诊断(PGD)检测胚胎染色体罗氏易位结果的一致性,为临床产前筛查提供理论借鉴。方法选取2018年5月至2021年3月在云南大学附属医院行体外受精-胚胎移植不孕妇女的临床资料84例进行研究,其配偶生殖功能正常,从胚胎营养液中提取样本分别行NICS、PGD检测,并进行比较分析。结果染色体异常主要集中在8、16、22号染色体上。NICS、PGD在检测染色体结构异常和染色体数量异常方面的阴性率与阳性率比较差异均有统计学意义(χ^(2)值分别为65.168、32.747;37.249、34.161,P<0.05);NICS、PGD在检测染色体结构异常和染色体数量异常方面具有一致性(Z=-0.243,P=0.808;Z=-1.000,P=0.317)。NICS、PGD在检测正常或者易位染色体和完全新发染色体异常的阳性率与阴性率鉴别检查比较差异均有统计学意义(χ^(2)值分别为17.155、9.972、15.786、6.364,P<0.05)。NICS、PGD在检测染色体罗氏易位类型方面具有一致性(Z=0.059,P=0.808)。受试者工作特征(ROC)曲线分析诊断效能显示:NICS和PGD的AUC(Z=-1.000,P=0.317)、灵敏度(χ^(2)=2.000,P=0.157)、特异度(χ^(2)=2.000,P=0.157)比较差异均无统计学意义。结论 NICS、PGD检测胚胎染色体罗氏易位均有效,适用于临床。

胚胎培养液中游离DNA应用于植入前遗传学筛查中的研究进展

植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)是指在体外受精-胚胎移植过程中,对具有高遗传风险患者的胚胎进行种植前活检和遗传学分析,选择遗传物质正常的胚胎植入母体宫腔,从而获得健康子代的诊断方法。目前,PGS仍主要通过胚胎活检获取细胞进行遗传学检测,而该有创过程可能会对胚胎发育及产科结局产生不良影响。近年研究发现胚胎培养液中含有胚胎来源的游离DNA片段,其含量与胚胎的碎片率呈正相关,并已在胚胎染色体及单基因疾病的检测和诊断方面得到了初步应用,开创了胚胎无创性PGS的先河。对胚胎培养液中游离DNA进行植入前遗传学筛查具有无创、取材简便、在分子水平检测胚胎的遗传物质等优点,有巨大的应用前景。但目前该技术尚处于研究阶段,存在易污染和特异性较差等问题,有待进一步完善。

无创产前胎儿染色体非整倍体筛查在辅助生殖单胎中的临床应用

目的比较分析二代测序无创产前染色体非整倍体筛查方法 (NIPT)在辅助生殖单胎组和自然妊娠单胎组的效能。方法回顾性分析2013年10月1日至2015年8月31日多中心联合进行无创产前筛查且获得筛查结果的单胎孕妇15 438例,其中自然妊娠单胎孕妇10 397例,辅助生殖单胎孕妇5 041例,对两组中21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征的阳性预测值进行卡方检验,并对两组的灵敏度、特异度进行初步比较分析。结果辅助生殖单胎组的21-三体综合征阳性预测值为82.86%,自然妊娠单胎组为96.77%,两组比较差异有统计学意义(P=0.024);辅助生殖单胎组的18-三体综合征阳性预测值为60.00%,自然妊娠单胎组为87.50%,两组比较,差异无统计学意义(P=0.163);辅助生殖单胎组的13-三体综合征阳性预测值为75.00%,自然妊娠单胎组为50.00%,两组比较,差异无统计学意义(P=1.00)。自然妊娠单胎组因发生1例21-三体综合征假阴性,其灵敏度为低于辅助生殖单胎组(98.36%vs.100.00%),两组的18-三体综合征、13-三体综合征灵敏度为100.00%。自然妊娠单胎组和辅助生殖单胎组的21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征特异度均高于99.80%。结论针对21-三体综合征的阳性预测值,尽管辅助生殖单胎组显著低于自然妊娠单胎组,辅助生殖单胎组21-三体综合征阳性预测值(82.86%)仍具有重要的临床应用价值;18-三体综合征、13-三体综合征的阳性预测值在两组间无明显差异;建议NIPT适用于辅助生殖单胎,临床咨询时需结合21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征的阳性预测值,灵敏度和特异度。

无创胚胎染色体筛查技术在染色体易位携带者胚胎植入前遗传学诊断研究进展

体外受精-胚胎移植(IVF-ET)辅助技术所获得的胚胎在39-65%以上存下染色体异常,而良好发育潜能的正常胚胎是成功妊娠乃至分娩的关键。如果能在胚胎植入前进行遗传学检测,将染色体正常的胚胎植入宫腔内,可有效提高反复移植失败或高龄患者的妊娠率以及分娩结局。然而,获取卵裂期胚胎细胞或胚囊滋养层细胞均属于有创操作,不仅降低胚胎质量,且存在0.6%-1.1%的流产风险,因此人们一直致力于早期、安全且精准的方式来排查胚胎染色体异常。近几年来,胚胎培养液中游离的DNA的发现为胚胎遗传学物质的无创检测提供可能。但关于无创胚胎染色体检测染色体易位应用研究鲜有报道,为此本文就对无创胚胎染色体筛查技术在染色体易位携带者胚胎植入前遗传学诊断研究进展做一综述,旨在为染色体易位携带者胚胎植入前遗传学诊断提供可靠依据。

无创胚胎染色体筛查在不同年龄段胚胎植入前遗传学检测的有效性

目的研究基于囊胚培养液及囊腔液的无创胚胎染色体筛查技术(NICS)在不同年龄段胚胎植入前遗传学检测(PGT)中的有效性。方法回顾性分析2019年1月至2021年6月于北京大学深圳医院行胚胎植入前遗传学检测助孕的62对夫妇,共310枚囊胚,行囊胚活检同时收集D3-6囊胚培养液及囊胚腔液行NICS,根据患者年龄分为3组:<35岁组,35~<40岁组,≥40岁组。分别在每组中将NICS结果与胚胎滋养细胞(TE)活检结果进行比较,计算一致性、灵敏度、特异度及阳性预测值、阴性预测值。然后将三个年龄段间NICS与TE的一致性、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别进行统计学分析。结果三个年龄段间NICS与TE的一致率差异无统计学意义(P>0.05),但高龄组(35~<40岁、≥40岁组)有上升趋势,特异度、灵敏度、阳性预测值差异均无统计学意义(P>0.05),≥40岁组阴性预测值与另2组差异有统计学意义(P<0.05)。结论NICS在不同年龄段的检测有效性差异无统计学意义,但在≥35岁的人群中检测有效性有上升趋势。

优化样品留取方法可提高囊胚培养液中游离DNA整倍性的检测效率

目的探讨利用囊胚培养液中游离DNA检测胚胎整倍性的样品留取优化方案。方法本研究共纳入239枚囊胚,所有的囊胚均来源于北京大学第三医院生殖中心胚胎植入前遗传学整倍体检测技术(PGT-A)周期。纳入患者的PGT-A指征为女方高龄(>38岁)、复发性流产、反复着床失败。胚胎在D3天更换囊胚培养液,并采取单胚胎单独培养,收集可以PGT-A活检囊胚的培养液。收集方法根据是否胚胎打孔以及胚胎培养时长分为三个阶段。PGT-A囊胚活检的滋养层细胞采用SNP芯片检测整倍性;培养液游离DNA采用二代测序方法(NGS)进行无创胚胎染色体整倍性筛查(NiPGT-A);背靠背比较两者的结果,分析NiPGT-A方法的检出率、NiPGT-A结果与PGT-A结果倍性一致性、整倍体符合率、非整倍体符合率、颗粒细胞污染率等。共有56枚PGT-A整倍性胚胎移植,分析对应胚胎的NiPGT-A结果,统计临床妊娠结局。结果239枚囊胚中209枚囊胚有NiPGT-A结果,检出率为87.5%。随着采样方法的改进,NiPGT-A结果与PGT-A结果倍性一致性、整倍体符合率逐渐提高;颗粒细胞污染率逐渐降低。239枚胚胎中有56枚PGT-A整倍体的胚胎移植,23枚胚胎的结局为活产/持续妊娠。NiPGT-A没有结果的胚胎妊娠率较高(71.4%),高于NiPGT-A为整倍体或者非整倍体胚胎的临床妊娠结局(33.3%,40.9%)。结论囊胚培养液的样品留取方法对于NiPGT-A检测至关重要,推荐D3天再次去除颗粒细胞、采集D4-D5/6天囊胚培养液,而且不要针对胚胎进行打孔处理。

下一代测序技术在遗传病临床检测中的应用

DNA测序技术已广泛应用于生物学研究,很多生物学问题也都可以借助测序技术予以解决。过去10年(2005-2015年),下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)逐步从新技术成长为主流的测序技术,并逐渐走进临床诊断领域。NGS以其简单、快速、高分辨率、高通量的特点,在传染性疾病防控、肿瘤的早诊早治、遗传病的早期筛查和诊断、无创产前筛查、胚胎植入前诊断和筛查等领域发挥越来愈大的作用,已成为目前临床领域最具有应用前景的技术之一。同时下一代测序技术领域仍在快速发展,新的测序技术及数据分析技术还在不断涌现,序列数据库和测序数据快速增加。下一代测序技术也有助于以更低廉的价格,更全面、更深入地来分析基因组、转录组及蛋白质相互作用组的各项数据。可以预见,各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段,有望给生物医学研究领域和医学临床诊断带来革命性的变革。本文主要针对下一代测序技术在无创产前诊断、遗传病检测、胚胎植入前诊断和筛查中的临床应用进行介绍和评述。

无创胚胎植入前遗传学检测方法

人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)发展至今已经成为治疗不孕不育症的重要方式,体外受精(in vitro fertilization,IVF)∕卵母细胞胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)-胚胎移植(embryo transfer,ET)是目前最有效的治疗手段。植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing,PGT)是在IVF的基础上,对植入前胚胎进行遗传学分析,选择一定遗传学特征的胚胎植入母体的技术。

冻融单囊胚移植胚胎选择策略的研究进展

现代体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)的新目标是选择和移植1枚最具发育潜能的胚胎,从而获得健康的单胎妊娠。为了实现这一目标,需要单胚胎移植并且达到最大化的单胎活产率。由于冻融囊胚移植较新鲜囊胚移植活产率高,且胚胎和子宫内膜之间的同步性更好,因此选择最优的冷冻单囊胚进行移植至关重要。本文综述了冻融单囊胚移植的潜在益处、单囊胚选择的非侵入性策略及不同发育速度囊胚的取舍。