用聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验检测无包埋体对虾病毒

聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测证明，某虾场发病的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）感染无包埋体对虾病毒（ＮＯＳＶ），或称中国对虾类杆状病毒（ＰｃＢＬＶ）；野生脊尾白虾（Ｅｓｏｐａｌａｅｍｏｎｃａｒａｉｎｉｃａｕｄａ）也感染ＮＯＳＶ，并可能经卵垂直传播；南美白对虾（（Ｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）亦可感染该病毒而发病。经ＰＣＲ扩增纯化的皮下及造血组织坏死症杆状病毒（ＨＨＮＢＶ）与ＮＯＳＶ的核酸结果表明，两者为同一种病毒。选取经ＰＣＲ检测的９份样品，重新编号后用ＥＬＩＳＡ法进行检测，两种方法判定的结果完全相同。将ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ双阳性的样品制备超薄切片，观察到ＮＯＳＶ感染的典型细胞病变。可以认为，在国内流行的中国对虾“暴发病”病原为ＮＯＳＶ。

无包埋体对虾病毒(NOSV)的纯化和随机文库构建

通过超薄切片和负染电镜观察，从患暴发性传染病死亡的中国对虾体组织中，发现一种无包埋体对虾病毒（ＮＯＳＶ）或称中国对虾类杆状病毒（ＰｃＢＬＶ）。对其用不连续蔗糖梯度离心纯化，观察了其核衣壳的负染结构：核衣壳平均大小为６２ｎｍ×３１４ｎｍ，由蛋白壳粒环堆砌而成，每３层环形成１个重复单位，重复单位之间有较大空隙；核衣壳一端较平，另一端近于帽状。提取纯化病毒的核酸，电泳后用低熔点琼脂糖回收，用ＥｃｏＲＩ酶切，克隆于ｐＵＣ１８质粒中，共获得１６个阳性克隆质粒，克隆片段总长度约５３．４５ｋｂ。

用对虾的致病病毒人工感染克氏原螯虾

用从对虾病料提取的无包埋体对虾病毒（ＮＯＳＶ）人工接种淡水的克氏原螯虾，螯虾发病死亡。再用死亡螯虾组织接种健康螯虾传代，传至第９代，接种的螯虾每代都发病死亡。用显微镜观察发病螯虾的组织切片，发现其胃、前肠上皮、鳃、结缔组织等的细胞核明显肿大和嗜伊红着染。经超薄切片观察，在发病螯虾的胃肠部、鳃组织的细胞核内有大量的杆状样病毒粒子，病毒大小为１１０～１４０ｎｍ×３４０～４３０ｎｍ，有囊膜，在细胞核内不形成包埋体。将人工感染致死的螯虾组织悬液上清回归健康对虾，对虾于１～５ｄ内死亡。显示对虾的ＮＯＳＶ人工感染螯虾已获成功。