无嘌呤嘧啶核酸内切酶在胰腺癌组织的表达及其临床意义

目的研究胰腺癌组织APE的表达及其与临床肿瘤指标的关系。方法(1)通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测4株胰腺癌细胞株APEmRNA的表达;(2)收集37例手术切除的胰腺癌及12例相应癌旁胰腺组织石蜡标本,应用EnVision免疫组化法分别检测癌组织和癌旁胰腺组织APE的表达情况。结果4株胰腺癌细胞株均有APEmRNA表达;37例胰腺癌中APE阳性表达33例(89.2%),其中APE胞核阳性表达7例(21.2%),胞质阳性表达5例(15.2%),胞质及胞核均表达21例(63.6%)。12例癌旁胰腺组织导管及腺泡呈阴性表达,胰岛胞质呈阳性表达,胰腺上皮内瘤变呈胞核阳性表达。APE阳性率与肿瘤分化程度,肿瘤大小、淋巴及远处转移无关(P>0.1)。结论APE在胰腺癌组织中有较高的阳性表达率,检测其定位的特异性表达可能有助于胰腺癌的早期诊断。

嘌呤核苷磷酸化酶/嘧啶核苷磷酸化酶共表达及固定化催化合成阿糖核苷

将嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和尿苷磷酸化酶(UP)进行共表达和双酶固定化,提高生物法合成阿糖核苷过程中底物转化率和催化剂稳定性。首先,构建大肠杆菌内源(PNP)和(UP)过表达工程菌,考察工程菌催化不同阿糖核苷之间转化的效率。将PNP和UP双酶固定化,并对固定化双酶进行回收利用,考察重复使用过程中固定化双酶的催化效率。结果表明:工程菌催化阿糖尿苷和腺嘌呤生成阿糖腺苷的反应最高转化率可达93.6%。固定化双酶催化合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷的最高转化率可达99.8%。重复回收使用固定化双酶19次后对底物的转化率达到60.6%,累计有效催化时长可达684 h。PNP和UP的双酶耦合体系能高效催化阿糖核苷之间的转化,固定化修饰有利于延长酶的使用寿命,为生物法生产核苷类似物提供重要科学参考。

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析。方法用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1。将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定。用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白。用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性。结果所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确。IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确。Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性。结论成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E.coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶与卵巢上皮性癌耐药相关性研究

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)与卵巢上皮性癌耐药性的相关性以及其在卵巢癌化疗耐药中的作用机制。方法应用免疫组织化学法对78例原发性卵巢上皮性癌组织和卵巢癌顺铂敏感株A2780、顺铂耐药株CP70中APE1的表达进行测定。结果APE1在卵巢上皮性癌组织中呈胞核表达、胞浆表达或核浆共同表达。化疗敏感组和耐药组的APE1表达强度间差异有统计学意义(P=0.045),核表达者化疗敏感率与浆表达、核浆表达者比较差异有统计学意义(P=0.037)。在卵巢癌顺铂耐药株CP70中APE1表达水平较顺铂敏感株A2780明显增高。结论APE1表达强度和定位与以铂类为基础化疗药物的敏感性相关,对卵巢癌的化疗疗效有提示作用,检测APE1对前瞻性预测化疗药物敏感性和判断化疗疗效具有一定的临床指导价值。

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1的研究进展

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶 /氧化还原因子 1(APE/Ref- 1)具有修复 DNA损伤、影响氧化还原反应及调节转录因子DNA结合活性等功能 ,对细胞的生存有重要作用。近年来有关 APE/Ref- 1的研究在其基因、功能、分布以及与某些疾病尤其是神经系统疾病和肿瘤之间的关系等方面都取得了长足的进展 。

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的制备人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAPE1)单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进行鉴定。方法以hAPE1融合蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,运用细胞融合、克隆化技术和间接ELISA法获得并筛选针对hAPE1的杂交瘤细胞,以体内诱生法产生腹水,并用Protein G柱亲和纯化得到hAPE1 mAb。采用秋水仙素阻断法、Western blot和间接ELISA法鉴定mAb的染色体核型、特异性、种属交叉反应、亚类、效价和亲和力,并应用于免疫荧光、免疫细胞化学和免疫组化实验中评价mAb性能。结果获得2株分泌稳定、高特异性的hAPE1 mAb的杂交瘤细胞株2-G1和4-F6,其效价均超过1:107,Ig亚类分别是IgG2b和IgG3,亲和常数分别为1.8×10-7和3.4×10-5,与兔、小鼠、大鼠无种属交叉性。2-G1mAb可应用于免疫细胞化学、免疫细胞荧光和免疫组织化学等实验技术中。结论成功获得2株稳定分泌抗hAPE1mAb的杂交瘤细胞株,产生的mAb具有高纯度、高效价和高特异性的特性,能特异性识别hAPE1天然蛋白和融合蛋白,为开展多种免疫学实验及研究提供必要的物质基础。

基于远红外荧光标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶活性检测方法的建立

目的建立远红外荧光标记的脱嘌呤脱嘧啶(apurinic/apyrimidinic,AP)核酸内切酶活性检测方法。方法通过5'标记远红外荧光基团(IR700)合成得到AP核酸内切酶活性检测底物,并通过与经典的同位素法对比,检验此方法的可靠性、灵敏度及实用性。结果远红外荧光标记法较传统的同位素法检测AP核酸内切酶更为敏感(10%上升到30%),且操作时间从传统的1 d缩减至2 h。结论远红外荧光标记法检测AP核酸内切酶活性更敏感,且操作方便、无放射性污染,易于推广。

脱嘌呤嘧啶核酸内切酶与肿瘤相关性研究进展

脱嘌呤嘧啶核酸内切酶 (APE)是一种具有DNA修复与氧化还原双功能的蛋白 ,在各种组织中普遍表达。其表达在肿瘤组织与正常组织比较 ,存在表达水平、部位的差异。肿瘤中该基因的突变并不多见 ,但存在一定数量的单核苷酸多态性 ,部分伴有氨基酸改变。APE还具有促进或抗凋亡作用 ,可调控活化蛋白 1(AP 1) ,对抑制肿瘤性克隆形成具有重要意义。

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体抗原表位的鉴定及应用

目的：研究鉴定人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体（hAPE1 mAb）的抗原表位,并建立定量检测hAPE1的ELISA一步法。方法：设计并合成APE1-15肽阵列,鉴定hAPE1 mAb 2-G1和4-F6的抗原表位,应用三维立体结构观察软件Molsoft.ICM-Pro模拟hAPE1 mAb抗原表位的立体结构;采用改良的过碘酸钠法标记抗体,以hAPE1 mAb为捕获抗体和酶标抗体,建立hAPE1的ELISA一步检测法。结果：APE1-15肽阵列检测结果和抗原表位三维结构显示,2-G1mAb的抗原表位对应为hAPE1天然蛋白氨基酸残基序列的76-90位和109-123位,位于氧化还原区域,为构象型抗原表位;4-F6 mAb的抗原表位对应为hAPE1天然蛋白氨基酸序列的109-147位,位于DNA修复内切酶活性区。ELISA一步法检测hAPE1蛋白的线性范围为8.0~200μg/L,最低检测限为2.0μg/L。平均批内变异系数为8.67%,平均批间变异系数为12.45%,平均回收率为105.47%。结论：hAPE1 2-G1 mAb和4-F6 mAb具有不同的抗原表位,成功建立的hAPE1 ELISA一步法为简便、快速、准确检测血清中hAPE1的含量奠定了基础。

人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在乳腺癌中的研究进展

在细胞内外各种生物因素的作用下,生物体基因组DNA出现累积损伤,一旦修复机制出现缺陷就可能引发癌症。在细胞修复DNA损伤后形成脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点时,人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)发挥关键作用,本文对于APE1基因与癌症的关系及其在乳腺癌中的研究现况做一综述。

人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在三阴性乳腺癌中的表达研究

目的检测人类脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶1（apurinic／apyrimidinic endonuclease／redox effector factor1，APE-1／REF-1）在乳腺癌中的表达，分析其与乳腺癌的临床病理特征的关系，及APE-1对三阴性乳腺癌患者预后的影响。方法采用免疫组化Envision两步法检测323例乳腺癌中APE-1蛋白的表达，其中108例为三阴性乳腺癌。计数资料采用，检验和Fisher精确检验。采用Kaplan—Meier法进行生存分析及Log—rank检验进行生存率的比较，并用COX比例风险回归模型进行多因素分析。结果APE-1在乳腺癌组织较癌旁组织有更高的表达，且在非三阴性乳腺癌中与肿瘤大小、腋窝淋巴结状态、临床分期、雌激素受体、人类表皮生长因子2型受体的表达显著相关（P〈0．05）。在三阴性乳腺癌中，APE-1表达与肿瘤大小（P=0．006）呈正相关，且APE-1低表达组有较好的生存率（P=0．007）。腋窝淋巴结阳性的三阴性乳腺癌患者中，APE一1低表达组有较好的预后（P=0．042）。结论APE一1是影响三阴性乳腺癌患者预后的独立因子，可能成为三阴性乳腺癌的潜在治疗靶点。

荧光分析法测定人体血液样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)的活性

目的:开发一种可快速、灵敏地检测生物样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)含量的荧光分析方法。方法:根据APE1所具有的脱碱基核酸内切酶活性,合成了一种用荧光基团与猝灭基团标记的含脱碱基位点的DNA荧光探针。在合适的缓冲体系下,APE1将该DNA探针水解并释放出荧光基团,根据荧光信号上升速率实现对APE1活性的定量检测。在此基础上,本研究改进了检测APE1时溶液缓冲液的条件,使得该荧光探针对APE1的响应更为灵敏,并进一步通过密度梯度离心法从人全血样品提取了外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用改进后的荧光探针法定量测定了其蛋白提取液中APE1的含量。最后,使用该荧光探针法测定了临床血液样本中APE1的含量。结果:本研究建立的方法对APE1的最低检测限和功能灵敏度均为0.005 U/mL(3 pg/mL),线性范围为6 pg/mL^1.2 ng/mL。利用该方法测定了8份人血液样品中PBMCs蛋白中APE1的含量,测得每微克PBMCs蛋白中APE1的含量分布为0.061~0.40 ng,平均含量为0.16 ng APE1,加标回收率为98%±5%( n =3)。用该方法对102份正常人(男51例、女51例,年龄59~75岁)血清样品中的APE1含量进行了检测,得到这些血清样品中APE1含量的分布范围为0.13~0.34 ng/mL,加标回收率为96%±15%( n =3)。结论:本研究发展的荧光分析法操作简便、灵敏度高、所需生物样品量小,能够快速、准确地测定血液等生物样本中的APE1含量,解决了原有方法检测低含量血清样品时误差较大的问题,有良好的临床检验应用前景。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1基因敲低人肺癌细胞A549构建及其对线粒体功能影响

目的建立脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1(APE1)基因敲低人肺癌细胞A549,并初步观察线粒体功能变化。方法 APE1基因shRNA序列与pSIREN-RetroQ慢病毒载体经酶切连接重组体(pSIREN-RetroQ-shAPE1),再与病毒包装质粒共转染293T细胞;收集病毒液并感染A549细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株A549^(shAPE1)。免疫印迹法检测稳定细胞株中APE1干扰效率。用双氧水处理A549^(shControl)和A549^(shAPE1)细胞24 h,分析细胞内ATP及活性氧(ROS)变化。结果经PCR和测序鉴定成功构建重组慢病毒载体pSIREN-RetroQ-shAPE1,免疫印迹法证实A549^(shControl)和A549^(shAPE1)稳定细胞株构建成功;双氧水处理后,A549^(shAPE1)细胞中ATP活性明显低于A549^(shControl)细胞(P<0.05),而ROS明显增加(P<0.01)。结论 APE1干扰可影响肺癌细胞中线粒体功能。

核酸水解产物嘌呤、嘧啶碱基在BDS柱上的分离及测定

用高效液相色谱法测定了核酸水解的中间产物及最终产物 6种嘌呤、嘧啶碱基 ,探讨了色谱柱、流动相等对其分离的影响 ,确定了最佳色谱条件为 :HypersilBDS C18柱 ,乙腈 0 1mol/LKH2 PO4 (H3 PO4 调节 pH至4 0 5 ) (体积比为 2∶98)作流动相 ,紫外检测器在 2 6 0nm波长下检测。方法的精密度在 3%以内 ,回收率在 82 %～ 114%。方法应用于酵母核酸样品的测定中 。

七种嘧啶碱和嘌呤碱的胶束电动毛细管色谱分离研究

研究了影响七种核酸碱基－胸腺嘧啶，尿嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，黄嘌呤和次黄嘌呤毛细管电泳分离的因素。在２４．５℃下，七种碱基在４０ｍｍｏｌ／Ｌ十二烷基硫酸钠－１０ｍｍｏｌ／Ｌ硼砂－１７％甲醇－３．０ｍｍｏｌ／Ｌβ－环糊精（ｐＨ９．３０）缓冲液中电泳可得良好分离。保留时间的变异系数小于１．８％（ｎ＝６）

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1在肿瘤发生发展及治疗中的作用研究进展

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(APE/Ref-1)是一种具有DNA修复和转录调控双重功能的蛋白质,其在肿瘤细胞中的高表达与肿瘤发生发展紧密相关。激素如17β-雌二醇可促进APE1/Ref-1的分泌,影响其表达。APE1/Ref-1抑制剂,如C10和E3330,已在实验中显示了抑制肿瘤细胞增殖和增强化疗药物敏感性的潜力,但APE1/Ref-1抑制剂的临床应用安全性和最佳时机需更多研究探讨。

卡尔曼滤波-紫外分光光度法同时快速测定4种嘌呤和嘧啶碱的含量

本文用卡尔曼滤波算法结合紫外分光光度法不经分离同时测定了腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)4种含氮碱混合物中各成分的含量。测得模拟混合样品中各种碱的平均回收率范围101.8％～107.7％。也可用卡尔曼滤波算法鉴别碱的种类。

萝卜硫素对脓毒症急性肺损伤大鼠氧化损伤及脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1表达的影响

目的评价萝卜硫素对脓毒症急性肺损伤大鼠氧化应激损伤及脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)表达的影响。方法按随机数字表法将60只Sprague-Dawley大鼠分成三组:假手术组、模型组和治疗组,每组各20只。假手术组仅进行剖腹和关腹操作,模型组和治疗组采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备大鼠脓毒症模型,治疗组大鼠在术后立即通过腹腔内注射给予50 mg/kg的萝卜硫素注射液,其余两组注入等量等渗NaCl溶液。于术后24 h右侧颈总动脉采集动脉血标本,然后处死大鼠取肺组织。光镜下观察病理学结果,测定肺组织湿/干比。同时,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺组织匀浆标本谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)表达情况,采用蛋白质印迹法检测肺组织APE1的表达。结果苏木素-伊红(HE)染色结果显示,假手术组肺组织结构清晰,未见明显水肿以及炎症细胞浸润;与假手术组相比,模型组大鼠肺组织病理形态学损伤严重,而治疗组肺组织损伤较模型组有所减轻。三组大鼠肺组织湿/干比(3.49±0.26、5.56±0.20、4.96±0.15)、动脉氧合指数(453±23、232±22、332±11)、GSH[(8.57±0.26)、(4.36±0.08)、(6.23±0.20)mg/g]及SOD表达水平[(91.0±3.0)、(55.5±2.5)、(72.1±2.4)NU/mg]比较差异均有统计学意义(F=107.897、128.676、275.863、183.797,P均<0.001)。进一步两两比较发现,模型组、治疗组大鼠肺组织湿/干比较假手术组均显著上升(P均<0.05),治疗组肺组织湿/干比较模型组下降(P<0.05);而模型组、治疗组动脉氧合指数及氧化损伤指标GSH和SOD水平较假手术组均显著下降(P均<0.05),且治疗组较模型组均上升(P均<0.05)。蛋白质印迹法结果显示三组大鼠肺组织APE1表达水平比较差异有统计学意义(F=453.991,P<0.001),进一步两两比较发现模型组、治疗组大鼠肺组织APE1表达较假手术组均显著下降(P均<0.05),但治疗组较模型组明显上升(P<0.05)。结论萝卜硫素可减轻脓毒症大鼠急性肺损伤,其机制可能与改善肺组织氧化应激反应及上调APE1表达有关。

脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶1在肝细胞癌中的表达及其意义

肝癌（HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其癌变是一个多步骤的渐进过程。脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶（APE）1，可修复损伤的DNA。APE1又名氧化还原因子1（Ref-1），可调节许多转录因子的DNA结合活性。我们采用免疫组织化学及原位杂交方法检测APE1在HCC中的表达情况，旨在探讨APE1基因表达在HCC的发生及恶性转化中的作用与地位。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在脂多糖介导肺微血管内皮细胞氧化反应中的调控作用

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)在脂多糖介导肺微血管内皮细胞(PMVECs)氧化反应中的调控作用。方法将体外培养人PMVECs分成4组:对照组(未加脂多糖的培养细胞)及各剂量脂多糖组(分别予以0.1、1、10μg/ml剂量脂多糖刺激培养细胞)。分别在脂多糖刺激6、12、24 h检测细胞内活性氧及一氧化氮的水平并进行比较。同时利用携带目的基因慢病毒载体转染PMVECs,将其分成对照组,脂多糖组,GFP组及APE1组。对照组为未加脂多糖的培养细胞,脂多糖组为1μg/ml剂量脂多糖刺激的培养细胞,GFP组为1μg/ml的脂多糖刺激培养慢病毒空载体转染的细胞,APE1组为1μg/ml的脂多糖刺激培养携带APE1基因慢病毒转染的细胞。在12 h检测细胞内活性氧、一氧化氮的水平以及细胞APE1的表达情况。结果与对照组比较,各剂量组脂多糖刺激6、12、24 h后一氧化氮及活性氧分泌明显上升(P均<0.05),且同一剂量组随着时间的推移,一氧化氮及活性氧分泌的比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。在转染PMVECs12 h后,脂多糖组APE1的表达明显低于对照组,而APE1组细胞APE1的表达较脂多糖组显著提高(P均<0.05)。与对照组相比,脂多糖组能够诱导PMVECs的一氧化氮及活性氧生成显著增加,而APE1组能够一定程度抑制一氧化氮及活性氧的产生(P均<0.05)。结论 APE1可通过抑制一氧化氮及活性氧的分泌从而减轻脂多糖介导PMVECs的氧化应激反应。