无机纳米酶在增强作物抗非生物胁迫中的应用研究进展

自然环境、地域差异以及人类活动等引起的非生物胁迫严重影响作物产量。无机纳米酶是由中国科学家提出的一类新型纳米催化材料,具有模拟甚至超越天然酶的功能,可在一定条件下遵循酶促反应动力学催化转化底物分子。近年来,随着植物纳米生物学的发展,无机纳米酶由于能够显著缓解作物因盐渍、旱涝、重金属等逆境引发的非生物胁迫而引起研究者的关注。本文梳理了无机纳米酶在缓解作物非生物胁迫方面的研究进展,阐述了其相关作用机制。具体地,归纳了施加方式对提高作物抵御非生物胁迫能力的影响,分析了无机纳米酶的材料种类与设计原则,总结了各方法的优缺点,并对目前无机纳米酶在农业生产应用中需解决的问题进行了展望。

无机焦磷酸化酶基因转化甘蔗的遗传研究

甘蔗是我国最为重要的糖料作物,也是一种重要的能源作物,提高甘蔗的含糖量是甘蔗育种的主要目标。通过农杆菌介导法将无机焦磷酸化酶(PPase)基因导入甘蔗,以期获得提高蔗糖含量的转基因植株。经过PPT抗性筛选获得72株抗性植株,并对其进行PPase基因和bar筛选标记基因的双重PCR检测,其中有13株都呈阳性。结果初步证明无机焦磷酸化酶基因已整合到甘蔗的基因组中。

马铃薯无机焦磷酸酶基因cDNA克隆及其反义植物表达载体构建

以马铃薯栽培品种大西洋(Atlantic)试管苗叶片为材料,用Trizol试剂提取总RNA,通过RT-PCR方法获得马铃薯PPase基因的cDNA片段,将该片段反向连接到克隆载体pBluescriptSK+,酶切鉴定后进行基因测序,所得PPase基因片断为673bp,编码211个氨基酸,与已克隆的PPase基因同源性达到97.62%。将该PPase基因反向插入到表达载体pBI121、pBIC和pBIrd中,分别构建了组成型启动子CaMV35S、块茎特异表达启动子CIPP和低温诱导表达启动子rd29A驱动的反义PPase基因植物表达载体,以期利用转基因技术培育出块茎休眠期延长或缩短的马铃薯新种质。

基于生物信息学分析的水稻无机焦磷酸化酶基因OsIP1的克隆及其遗传转化

无机焦磷酸化酶在植物体内催化焦磷酸基团分解为磷酸基团的反应,而焦磷酸的及时降解,被认为是原初光合产物合成双糖特别是蔗糖,进而进行长距离运输的关键步骤之一。但是,蔗糖在维管束中的运输需要焦磷酸,因此,在叶肉细胞中特异性过表达焦磷酸化酶基因,被认为是拉动和促进光合作用的关键措施之一。对水稻中约30个无机焦磷酸化酶编码基因进行氨基酸序列比较、结构域特征、亚细胞定位预测以及上游顺式元件释义等生物信息学分析,进而克隆了1个预测为编码胞质型可溶性无机焦磷酸化酶的基因OsIP1(Os04g0687100),并将其与叶肉细胞特异性启动子cyFBPase相连,构建成嵌合基因cyFBPase:OsIP1;通过农杆菌转化法将其转入2个水稻品种中,累计获得48个阳性转基因植株。

转PPase基因对马铃薯无机焦磷酸酶活性和无机磷含量的影响

对转正义和反义无机焦磷酸酶(PPase)基因马铃薯PPase活性及其测定最适条件和无机磷(Pi)含量进行了研究,结果表明,PPase活性测定最适pH值是8.0,最适温度是42℃,二价阳离子以Mg2+最好。叶片中PPase活性和Pi含量较高,茎和生长期微型薯中PPase活性和Pi含量较低,贮存3个月的微型薯中PPase活性和Pi含量比生长期块茎更低。另外,与未转基因的对照相比,转正义PPase基因提高了转基因马铃薯中PPase活性和Pi含量,转反义PPase基因降低了转基因马铃薯中PPase活性和Pi含量。

酿酒酵母胞内无机焦磷酸酶的分离纯化及性质

An inorganic pyrophosphatase (EC3.6.1.1) from Saccharomyces cerevisiae was purified to PAGE homogeneity by sonication disruption. (NH4)2SO4 fractionation and DEAE-cellulose colunm chromatography. The optimum pH and temperature of the enzyme were 7.4～7. 8 and 60℃, respectively. The Km was 19.3 mmol / L. The enzyme required Mg2+ as a cofactor for hydrolysis of pyrophosphate and was inhibited by Ca2+, Hg2+, Pb2+, Mn2+.

沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

植物自交不亲和性是植物生殖过程中普遍存在的一种现象,是植物特异性识别并拒绝自身花粉或亲缘关系很相近的花粉的一种遗传机制。无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,IPPase)在植物生长发育方面起重要作用。该研究根据沙田柚花柱消减文库中EST序列(无机焦磷酸酶基因内部片段),设计了2对特异引物5'-GSP1,5'-n GSP1,3'-GSP2 and 3'-n GSP2,通过SMART-RACE PCR技术从所构建的沙田柚花柱抑制性消减文库中克隆了沙田柚无机焦磷酸酶基因的c DNA全长序列,利用Blastn、DNAman和Expasy软件对所克隆的基因进行同源性分析,以及基因编码的氨基酸的分子量、等电点、疏水性等理化性质分析。结果表明:IPPase基因c DNA全长为1 136 bp(Gen Bank登录号为KF990474),开放阅读框(ORF)全长为654 bp,共编码217个氨基酸,包括170 bp 5'UTR和312 bp的3'UTR;编码的蛋白质的分子量为24.4 k Da,等电点为5.96;蛋白结构域分析显示沙田柚IPPase与焦磷酸酶具有相同的保守结构域;对沙田柚IPPase蛋白质序列进行疏水性分析,结果表明沙田柚IPPase基因编码的肽链中疏水性最大值约为3.21,最小值约为-2.98,属于亲水性蛋白,无跨膜区域;Blastn搜索的结果显示,沙田柚IPPase基因序列与多种植物的IPP基因高度同源;序列分析表明,沙田柚IPPase基因核苷酸的同源性与毛果杨(Populus trichocarpa)和橡胶树(Hevea brasiliensis)IPPase基因均为87%;氨基酸序列与克莱门柚(Citrus clementina)无机焦磷酸酶完全一致。该研究结果可为深入研究无机焦磷酸酶在沙田柚自交不亲和中的作用机理提供基础。

球形红细菌无机焦磷酸酶的原核表达、纯化及初步分析

无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,PPase)水解在许多生物大分子的生物合成过程中产生焦磷酸并释放能量,形成的热力学拉力可促进合成反应的进行。球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)无机焦磷酸酶(RsPPase)属于II型可溶性焦磷酸酶,钴离子对于其活性的维持具有重要的功能,而其活性调控及其表达对细菌生长的影响尚未报道。研究克隆、原核表达纯化RsPPase。结果发现,钴离子会导致谷胱甘肽S-转移酶(glutathione sulfotransferase,GST)标签不能进行蛋白酶切,且融合蛋白GST-PPase水解焦磷酸的催化效率较低(Km/kcat=2.0×104mol(/L.s));在球形红细菌胞内表达大肠杆菌焦磷酸酶(Km/kcat=5.5×107mol/(L.s))没有影响细菌的生长,暗示球形红细菌胞内PPase活性足够高。通过对其结构的模拟推测,在钴离子存在的情况下为闭合构象,GST标签的存在可能影响PPase羧基端结构域的运动,而影响其结合底物和释放产物的能力;在钴离子不存在的情况下为开放构象,GST标签具有较大的自由度,可暴露蛋白酶识别位点酶切产生无标签RsPPase。

玉米可溶性无机焦磷酸酶家族基因的克隆和表达分析

可溶性无机焦磷酸酶(Soluble inorganic pyrophosphatase)通过水解作用调节细胞质中无机焦磷酸盐(PPi,pyrophosphate)的含量使其维持在适当水平。本研究一共克隆了玉米(Zea mays L.)中7个可溶性无机焦磷酸酶基因Zm PPases,分别位于第2、4、5、6、8、10号染色体上。同源基因分子量介于22.8~25.6 kDa之间,等电点介于4.84~6.24之间。可溶性无机焦磷酸酶蛋白的二级结构主要由α螺旋和β折叠构成。系统进化分析表明可溶性无机焦磷酸酶基因在玉米、水稻(Oryza sativa L.)、高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)和拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)物种中可以分为3组。亚细胞定位进一步揭示了玉米可溶性无机焦磷酸酶在细胞膜和细胞核中表达。此外,在不同非生物胁迫(盐和干旱)下Zm PPases基因表现出不同的应激反应,除了Zm PPase2.1(Zm00001d051564)在盐胁迫下表达下调,其余Zm PPases在盐和干旱胁迫下均表达上调。本研究通过对Zm PPases家族成员序列及表达进行全面分析,为进一步探讨Zm PPases的基因功能提供理论基础。

日本血吸虫无机焦磷酸酶的克隆表达及蛋白特征分析

目的克隆并原核表达日本血吸虫无机焦磷酸酶(SjIPP),分析SjIPP的蛋白特征。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,克隆SjIPP,重组入pET28a质粒,并将重组质粒转化入E.coli BL21,用SDS-PAGE和Western blot法鉴定重组蛋白的表达和特异性,进一步分析SjIPP的蛋白特征和同源性。结果克隆和表达出的SjIPP均与预测的分子量大小一致,Western blot法结果显示,重组蛋白可被小鼠抗His-tag单克隆抗体特异性识别。生物信息学分析表明,SjIPP为胞内蛋白,含有多个磷酸化位点,B细胞表位丰富,且与人和小鼠的IPP高度同源。结论成功克隆表达出SjIPP,为进一步利用SjIPP奠定基础。

球形红细菌无机焦磷酸酶的寡聚化及酶活性分析

球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是一种重要的微生物资源,其无机焦磷酸酶(PPase)属于Ⅱ型可溶性焦磷酸酶.通过原核表达和纯化,得到了正常型Rs PPase和突变型Rs PPasemono,进一步进行了寡聚化和酶活性分析.结果表明:突变型Rs PPasemono为单聚体,在钴离子存在条件下会导致谷胱甘肽S-转移酶(glutathione sulfotransferase,GST)标签进行蛋白酶切,且去标签后的Rs PPasemono催化效率较高(Kcat/Km(PPi)=12.64L·μmol-1·min-1),相对于Rs PPase-GST提高了12倍;在无钴离子存在条件下仍能进行蛋白酶切,且保持催化效率(Kcat/Km(PPi)=0.34 L·μmol-1·min-1).

酿酒酵母无机焦磷酸酶基因在大肠杆菌中的表达及其意义

目的:利用大肠杆菌表达酿酒酵母无机焦磷酸酶(Y-IPPA),获得具有活性的酿酒Y-IPPA。方法:以酿酒酵母基因组为模版,通过查询NCBI获得酿酒酵母无机焦磷酸酶序列,设计引物,用PCR方法获得酿酒Y-IPPA基因序列,插入克隆性载体pMD○R 19-T Simple Vector中,并转化至大肠杆菌DH5α扩增,获得重组质粒,经酶切及测序验证正确后,将酶切的目的片段插入到原核表达载体p ET28(a)中,再转化大肠杆菌DH5α扩增,经酶切及测序验证正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达蛋白,通过IPTG诱导表达出Y-IPPA,以金属离子亲和层析蛋白纯化系统纯化蛋白,并测定其比活和酶学性质。结果:获得与pMD○R 19-T SimpleVector一致的Y-IPPA碱基序列,构建了重组表达质粒pET28(a)-Y-IPPA,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导并进行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为32 000处可见Y-IPPA蛋白条带;镍柱亲和层析纯化目的蛋白,其中一组的蛋白浓度、活性和比活分别为0.312g.L-1、31.13units.mL-1和99.73uints.mg-1。结论:成功制备Y-IPPA蛋白,为进一步研究其酶学性质奠定了基础。

茶尺蠖无机焦磷酸酶EoPPase672的表达与功能研究

【目的】本研究旨在通过克隆茶尺蠖Ectropis obliqua解毒相关无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,PPase)基因EoPPase672,并对其进行原核表达和功能验证,为更好地了解EoPPase672在茶尺蠖解毒过程中的作用及相关功能的应用提供理论依据。【方法】从茶尺蠖转录组数据库中筛选到EoPPase672 cDNA,构建原核表达载体pET-32a-EoPPase672,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;测定EoPPase672的浓度以及酶促反应最适温度、最适pH和最适金属离子。利用qRT-PCR检测亚致死浓度(LC_(10)=2.08 mg/L)溴氰菊酯刺激后不同时间不同龄期茶尺蠖幼虫中EoPPase672的表达水平。基于PPase的特性,分析重组蛋白EoPPase672在PCR反应中对焦磷酸盐(PPi)的去除效果和对PCR扩增效率的影响。【结果】通过原核表达和纯化获得重组蛋白EoPPase672。通过无机磷酸盐(Pi)含量标准曲线测得该酶的比活力为1279.6 U/mg,酶促反应的最适温度为65℃、最适pH为7.5、最适金属离子为Mg^(2+)。茶尺蠖幼虫被溴氰菊酯(2.08 mg/L)刺激12 h后,2和3龄幼虫EoPPase672的表达量与对照组的相比显著上调,4龄幼虫EoPPase672的表达量小幅上调;被溴氰菊酯刺激24 h后,2和3龄幼虫EoPPase672的表达量与对照组的相比仍然显著上调,但与刺激12 h的2和3龄幼虫中的相比下调。在PCR反应中添加重组蛋白EoPPase672后,部分PPi被水解,解除了PPi对PCR扩增的抑制作用,对PCR扩增效率起到了增强效果。【结论】这些结果表明,重组蛋白EoPPase672可提高PCR扩增效率,EoPPase672基因可能参与了茶尺蠖的解毒过程。研究结果为进一步研究茶尺蠖EoPPase672的功能提供了依据。

叶肉细胞特异表达焦磷酸化酶基因OsIP1在不同源库类型水稻品种中的效应

将水稻自身焦磷酸化酶基因OsIP1置于叶肉细胞特异表达启动子下,利用农杆菌介导法将嵌合基因cyFBPase:OsIP1分别导入"源限制型"水稻品种中超123和"库限制型"品种农垦57。根据荧光定量PCR结果和农艺性状,筛选高表达且农艺性状没有明显改变的T2转基因纯合株系,用以检测和分析在水稻叶肉细胞中特异性过表达水稻焦磷酸化酶基因的效应。初步的研究结果显示:1)在营养生长期,转基因株系的最高茎蘖数和穗数比各受体亲本均有不同程度的提高,尤其是在分蘖性较强的品种上;2)在籽粒灌浆结实期,叶片、叶鞘中可溶性总糖、蔗糖和淀粉含量在整个灌浆期的变化趋势与对照相似,且多数转基因植株叶片和叶鞘中的蔗糖含量(除了灌浆高峰期时的叶鞘)均显著高于对照;3)转基因株系单株干物质量较野生型对照有显著提高。单株产量呈现不同程度的增加,其中"源限制型"品种中超123转基因株系单株产量较对照增幅达显著水平。

胰蛋白酶-磷酸铜纳米花的制备与催化水解性能

固定化酶可以增强酶的稳定性与可重用性,降低酶的使用成本。采用有机-无机纳米花固定化酶具有合成简单,绿色温和等优点,同时可以提高酶活性和稳定性。本文以磷酸铜为无机组分,胰蛋白酶为有机组分,成功制备了胰蛋白酶-磷酸铜纳米花(TR-Cu_(3)(PO_(4))_(2)),对其形貌组成进行分析并研究了其催化水解性能。结果表明,所制备的纳米花酶载量达到109.1 mg/g,通过催化模拟底物BAEE计算其酶活性为40.4 U/mg,是游离酶的416%。

转PPase基因对马铃薯块茎休眠相关生理特性的影响

马铃薯块茎的休眠和发芽对于马铃薯栽培、贮藏保鲜和加工等具有十分重要的意义。本研究以25℃室温条件下贮藏90d后的转正义和反义无机焦磷酸酶(PPase)基因马铃薯Favorita的块茎为材料,对贮藏块茎的PPase活性和及Pi、可溶性糖、淀粉、蛋白质含量进行了测定,以探讨PPase基因对马铃薯相关休眠生理特性的影响。结果表明,与对照相比,转正义PPase基因的两个株系F-2-1和F-2-4块茎中的PPase活性、Pi含量和可溶性糖含量增加、淀粉含量和蛋白质含量降低,且与对照相比均达到极显著水平(只有F-2-4淀粉含量与对照相比无显著性变化);转反义PPase基因的两个株系F-1-1和F-1-2块茎中PPase活性、Pi含量和可溶性糖含量降低、淀粉含量增加,与对照相比均达到极显著性水平,而蛋白质含量与对照相比无显著性变化。

刚毛柽柳液泡膜H^+转运无机焦磷酸酶ThVP3的克隆与表达分析

通过对刚毛柽柳转录组的分析,获得并克隆了1个H^+-PPase基因cDNA全长,命名为ThVP3。序列分析结果表明:ThVP3全长3 500 bp,包含2 406 bp完整的开放读码框,618的5'非编码区和476 bp的3'非编码区。该cDNA编码1个801个氨基酸的多肽,等电点为5.67,推测分子质量为84.86 k D。通过与其他物种的氨基酸多序列比对及系统进化树分析,发现ThVP3氨基酸序列与AtVP2(拟南芥)一致性达88%,属于Ⅱ型VP成员。ThVP3基因有15个跨膜区,并具有高度保守的3个结构域(CS1,CS2,CS3)。相对荧光定量RT-PCR结果表明,ThVP3在高盐及干旱胁迫下均呈现为表达上调,但在各胁迫时间点和不同组织中的表达模式有所差异,0.4 mol/L Na Cl胁迫处理下,地下部分3 h达到最大值后有不同程度的降低,地上部分24 h达到最大值,与地下部分比,地上部分呈现较高的表达量;20%(w/v)PEG 6000胁迫处理下,地下部分在3 h和12 h达到峰值,地上部分表达量逐渐升高,24 h达到最大值后逐渐降低,96 h达到第2个峰值。ThVP3的表达受盐旱胁迫的诱导,推测其可能在柽柳的胁迫应答中起着重要的作用。

滇重楼可溶性无机焦磷酸酶基因的克隆及原核表达研究

目的为了研究可溶性无机焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophosphatase,s PPase)基因在滇重楼生长发育中的功能,对滇重楼的s PPase基因进行了克隆、序列分析和原核表达研究。方法根据滇重楼c DNA文库中筛选到的s PPase的EST序列,克隆了滇重楼可溶性无机焦磷酸酶基因Pps PPase的c DNA全长序列;运用生物信息学的方法对该序列进行相似性比较和同源性分析,预测编码蛋白,并对其进行各种理化性质分析;将Pps PPase插入到原核表达载体p EASY-E1上,并导入到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行诱导表达。结果滇重楼中Pps PPase的开放阅读框ORF为621bp,编码206个氨基酸,与高粱中s PPase的氨基酸序列相似性最高为94%;Pps PPase编码的蛋白相对分子质量是23.4k Da,理论等电点p I为5.6,特异识别区域即位于98-104位之间即DNDPMDV。成功构建了原核表达载体p EASY-E1-Pps PPase,并导入到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,经SDS-PAGE分析表明Pps PPase在大肠杆菌中能够表达,当IPTG诱导2h时表达量较高。结论首次从滇重楼中克隆得到可溶性无机焦磷酸酶基因Pps PPase,为滇重楼生长发育分子机制的研究提供参考。

LHPP对上皮性卵巢癌恶性行为的影响及其机制研究

目的:探讨磷酸化磷酸组氨酸无机焦磷酸酶(LHPP)对上皮性卵巢癌恶性行为的影响及其机制。方法:选择2016年9月至2019年9月在青岛市市立医院留存的上皮性卵巢癌及正常卵巢的新鲜组织和石蜡切片,采用免疫组化法检测LHPP在上皮性卵巢癌和正常卵巢组织中的表达;应用CCK-8增殖实验和平板克隆实验检测LHPP对卵巢癌细胞增殖能力的影响;Transwell小室实验检测对细胞侵袭、迁移能力的影响;蛋白印迹法检测上皮间质转化(EMT)相关生物标志物的表达。结果:LHPP在卵巢癌组织中的表达水平显著高于正常卵巢组织(P<0.01),上皮性卵巢癌中LHPP蛋白的表达水平与手术病理分期、组织学分级、肿瘤糖类抗原125(CA125)水平明显相关(P<0.05),而与患者年龄是否>50岁、病理类型和肿瘤直径均无关(P>0.05)。高表达LHPP组的卵巢癌细胞生长速度、克隆形成数、穿膜细胞数明显高于对照组。高表达LHPP后,上皮表型标志物表达下调,而间质表型标志物表达上调。结论:LHPP在上皮性卵巢癌中高表达,可能通过调控EMT过程,促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭及迁移,有望成为上皮性卵巢癌的预后标志物及临床治疗靶点。

转PPase基因对马铃薯块茎休眠特性的影响

利用农杆菌介导法将组成型表达启动子CaMV35S驱动的正义和反义无机焦磷酸酶（PPase）基因导入到马铃薯栽培品种‘费乌瑞它’的试管薯中，通过PCR检测证明PPnse基因已转入马铃薯基因组中．对转基因株系及对照植株块茎的休眠特性的测定表明，分别在4℃低温和25℃室温贮藏条件下的转反义基因马铃薯株系块茎的休眠期较对照株系均延长了2～3周；转正义基因马铃薯株系块茎的休眠期较对照株系均提前了2～3周；且在4℃低温贮藏条件下的转基因马铃薯株系及对照块茎的休眠期比25℃条件贮藏的长2～3周，为进一步利用PPase基因改良马铃薯块茎休眠特性提供科学依据．