LT质粒的新法提取及无毒突变体LTS63K的构建和序列分析

目的 获取野生型产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素 (LT)基因、构建LTS63K突变体并进行序列分析。方法 用改进的细菌基因组提取含野生型LT基因质粒 ,用PCR技术扩增LT的DNA ,并亚克隆至pMD1 8 T中进行点突变和序列分析。结果 从野生型大肠杆菌提取大质粒的新法可行 ,所克隆的LT基因与GenBank公布的完全一致 ,点突变正确。

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。

人免疫缺陷病毒包膜蛋白V3多肽与白喉毒素无毒突变体CRM197结构域A融合蛋白的免疫原性分析及单克隆抗体筛选

目的 评估CRM197-HIV-V3作为HIV表位疫苗的潜力,以此筛选HIV单克隆中和抗体,为后续疫苗和治疗性抗体的研究奠定基础。方法 将HIV-1 NL4-3 V3肽（299~328 aa）展示在白喉毒素无毒突变体A结构域（CRM197-A）上,利用大肠杆菌原核表达系统进行表达。纯化后的融合蛋白免疫6~8周龄的雌性Balb/c小鼠,免疫3针后,进行脾脏免疫加强,后将小鼠的脾细胞与小鼠杂交瘤细胞进行融合实验。利用基于免疫斑点印迹法（ELISPOT）的HIV中和筛选平台筛选单克隆抗体,对获得的单抗进行抗原性的分析。结果 构建克隆后,成功表达了NL4-3 HIV V3肽融合蛋白（CRM197-A-V3）,免疫小鼠的多抗血清对NL4-3株HIV病毒的中和效价约为103,ELISA检测多抗血清结合CRM197-A-V3抗原效价达到105。通过融合筛选和单细胞克隆化获得8株单克隆抗体。ELISA结果显示与NL4-3-gp120蛋白有较好的结合活性。中和实验结果显示抗体对NL4-3株HIV病毒有很好的中和能力,NC50为0.02μg/m L。结论 本研究将HIV V3表位展示在CRM197-A上,成功刺激小鼠产生免疫反应,筛选获得特异性针对NL4-3株HIV的中和单抗。

反相高效液相色谱法检测白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白纯度

目的 建立反相高效液相色谱法(reverse phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)检测白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白纯度。方法 利用Agilent AdvanceBio RP-mAb SB-C8(100 mm×2.1 mm)分析柱和Agilent1260高效液相色谱系统,以含0.1%三氟乙酸水溶液-异丙醇(98∶2)为流动相A,以含0.1%三氟乙酸乙腈溶液为流动相B,进行梯度洗脱,体积流速为0.5 mL/min,检测波长为280 nm,柱温为65℃,进样体积为10μL,采用面积归一法检测CRM197蛋白纯度,并对方法的适用性、专属性、重复性、中间精密度、线性、灵敏度和耐用性指标进行考察。用建立的方法检测CRM197蛋白酸处理供试品溶液、碱处理供试品溶液及3批原液的纯度。结果 建立的方法系统适用性良好;专属性验证表明空白溶液在目标峰积分范围内无干扰峰,热处理CRM197蛋白目标峰与其他杂质峰分离度>1.5;6次重复进样目标峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.14%,保留时间RSD为0.81%;中间精密度分析目标峰面积RSD为1.62%,保留时间RSD为0.06%;CRM197蛋白含量在20~2 000μg/mL范围内,与峰面积存在良好的线性关系(R^(2)=0.999 8);最低检测限为10μg/mL,定量限为20μg/mL;在改变柱温色谱条件时,目标峰面积百分比与保留时间均RSD≤5.00%,耐用性研究合格。对酸处理、碱处理供试品溶液及3批原液进行纯度检测,纯度在76.5%~96.9%,结果准确。结论 建立的RP-HPLC检测CRM197蛋白纯度的方法,经验证各项指标均符合要求,可用于CRM197蛋白的纯度检测。

白喉毒素无毒突变体H21G蛋白的分泌性表达及纯化

目的原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础。方法以p ET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至p ET22b载体中,构建重组原核表达质粒p ET22b-H21G,转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导重组H21G蛋白分泌性表达。重组蛋白经渗透压休克,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6FF（high sub）疏水层析纯化后,使用还原/非还原SDS-PAGE和HPLC法分析纯化蛋白的纯度,窄范围等电聚焦分析其等电点,MALDI-TOF质谱法分析其相对分子质量,N-末端测序法鉴定N-末端氨基酸序列。结果重组原核分泌性表达质粒p ET22b-H21G经双酶切（NcoⅠ和XhoⅠ）和测序证明构建正确;目标蛋白以可溶形式存在于宿主菌周质间隙,表达量为10%-15%;经纯化后,重组蛋白纯度达95%以上,等电点在4.55-6.20之间,相对分子质量和N-末端氨基酸序列均与白喉毒素相符合。结论成功分泌性表达并纯化了重组白喉毒素无毒突变体H21G蛋白,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定了基础。

重组白喉毒素无毒突变体CRM_(197)柱复性及纯化工艺的优化

目的优化重组白喉毒素无毒突变体CRM197(recombinant cross reacting material 197,rCRM197)柱复性及纯化工艺。方法将Sephacryl S-200凝胶柱复性和Q Sepharose FF强阴离子交换层析结合,复性和纯化rCRM197;通过正交试验L9(34)考察凝胶层析复性时流速、离子交换层析纯化的pH值、淋洗液中NaCl浓度和洗脱液中NaCl浓度4种因素对rCRM197纯度及回收率的影响,筛选rCRM197复性及纯化的最佳工艺。结果包涵体经Sephacryl S-200凝胶柱复性后,相对分子质量小于36 000的杂质已被去除;经Q Sepharose FF离子交换层析后,rCRM197纯度达95%以上;在复性时流速为10 ml/min、离子交换层析纯化的pH值为7.5、淋洗液为50 mmol/L Tris-Cl+30 mmol/L NaCl、洗脱液为50 mmol/L Tris-Cl+50 mmol/L NaCl的条件下,rCRM197能达到纯度和回收率的共平衡。结论已筛选出rCRM197复性及纯化的最佳工艺,该工艺操作简便,制备的rCRM197纯度高,适用于rCRM197的产业化。

紫外分光光度法测定白喉毒素无毒突变体CRM197的蛋白含量

目的基于紫外分光光度法,建立一种测定白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白含量的方法。方法在天然折叠状态和非折叠状态(CRM197蛋白经盐酸胍变性)下,分别测定相同含量的CRM197蛋白A_(280 nm)值,再根据朗伯-比尔定律c=A/εL计算其折叠状态消光系数。同时,使用当前建立的方法与BCA法分别测定CRM197蛋白的含量,并对2种方法的差异和检测特点进行比较分析。结果根据CRM197蛋白的氨基酸一级序列与相对分子质量计算出其理论消光系数为0.934 mL/(mg·cm),在280 nm处的实验消光系数为(0.959±0.006)mL/(mg·cm)。2种方法测定同一蛋白样本的结果一致,分别为(2.17±0.02)mg/mL和(2.14±0.09)mg/mL;本方法检测值的CV为0.70%,BCA法检测值的CV为4.15%。结论本研究建立的CRM197蛋白含量测定方法准确性高、线性范围宽、获取数据快,可用于CRM197蛋白含量的测定,同时为其他载体蛋白的含量测定提供了参考。

白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的结构确证分析

目的对本公司制备的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白进行结构确证分析。方法通过发酵、提纯制备3批CRM197蛋白,经N-末端序列、C-末端序列、质量肽图和肽段覆盖率分析进行一级氨基酸序列结构确证分析,经圆二色谱法进行二级蛋白结构确证分析。结果3批CRM197蛋白N-末端均为GADDVVDSSK,C-末端均为FEIKS,质量肽图的紫外图谱高度一致,肽段覆盖率为100%,一级结构与标准CRM197蛋白氨基酸序列完全一致。3批CRM197蛋白二级结构测算值比例差异不大,批间稳定。结论本公司自制的3批CRM197蛋白与标准CRM197蛋白结构基本一致,为研制以CRM197为载体蛋白的多糖-蛋白结合疫苗及其产业化生产奠定了基础。

柯萨奇病毒A组6型VP1与白喉毒素无毒突变体GRM197融合蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)VP1蛋白与白喉毒素无毒突变体CRM197片段A的融合蛋白(CRM197A-CVA6 VP1),并评价其免疫原性。方法将经密码子优化的CRM197A基因与CVA6 VP1基因连接,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-CRM197A-CVA6 VP1,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱层析及透析复性后获得重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1,检测重组蛋白的粒径及电位,并进行蛋白荧光光谱检测。经沙鼠腹腔注射免疫铝佐剂吸附的重组蛋白CRM197A-CVA6VP1,20μg/(只·0.5 mL),同时设对照组(等体积的铝佐剂);1周后进行加强免疫,免疫途径及剂量同上。首次免疫后4周,经沙鼠眼眶采血,分离血清,ELISA法检测血清结合抗体,微量细胞病变法检测血清中和效价。相同方法对沙鼠进行分组及给药,于初次免疫4周后,经沙鼠腹腔接种CVA6病毒液,1×10^(4)TCID_(50)/只,观察沙鼠的存活情况。结果测序结果表明,重组表达质粒pET-28a-CRM197A-CVA6 VP1构建正确。重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1的粒径为81.16 nm,电位为23.12 mV,280 nm激发光下检测到最大发射波长为353 nm,纯度达88.3%。试验组及对照组沙鼠血清中结合抗体效价的几何平均数分别为44565和0,中和抗体效价的几何平均数分别为30.4和0,两组间结合抗体效价和中和抗体效价的几何平均数差异均有统计学意义(P均<0.05)。对照组沙鼠于攻毒后第3天开始出现死亡,第13天全部死亡;试验组沙鼠在攻毒过程中未发现死亡,保护率达100%。结论原核表达的重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1在沙鼠体内可产生良好的免疫原性。

黏膜佐剂mLT63及CpG-ODN鼻内免疫的佐剂作用

目的研究大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63和CpG-ODN鼻内免疫对抗原的佐剂效应。方法选用破伤风类毒素(TT)和小牛血清白蛋白(BSA)为抗原,mLT63和CpG-ODN为佐剂,经鼻内免疫BALB/c小鼠。ELISA间接法检测免疫小鼠血清和肺、直肠及阴道组织萃取液的特异性抗TT、BSA的IgA、IgG水平。结果mLT63和CpG-ODN均能协助TT和BSA抗原在血清、肺、阴道、直肠组织中诱导出高滴度的IgG抗体。在血清中IgA抗体滴度均比较低,而TT-IgA在肺和阴道组织中滴度较高,BSA-IgA在肺组织中滴度较高。各佐剂组之间IgG和IgA抗体水平相比,差异均无显著意义。不同剂量的mLT63诱导的BSA-IgA抗体水平差异无显著意义。结论mLT63和CpG-ODN经鼻内免疫对TT和BSA抗原均有良好的佐剂作用。

23F型肺炎球菌多糖与CRM197蛋白结合物制备及特性研究

目的采用改良胺化还原法,白喉无毒突变体CRM197蛋白作为载体,制备23F型肺炎球菌多糖蛋白结合物。方法在还原胺法的基础上,以1,6-己二酰肼(ADH)为分子臂,在碳二亚胺(EDAC)作用下衍化CRM197蛋白,衍化后蛋白再与多糖上的醛基反应,形成共轭结合;采用高效液相色谱技术(HPLC)、免疫扩散等方法分析结合物,并将获得的结合物免疫NIH小鼠,用ELISA方法检测多糖IgG水平。结果 HPLC图谱和免疫扩散检测结果证明了结合物的获得;动物免疫产生了较多糖高的抗23F肺炎多糖抗体,并有免疫记忆发生。结论采用改良还原氨化法可以制备出动物免疫原性良好的23F型多糖蛋白结合物。

两种ACYW135群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合疫苗的制备及质量与免疫原性分析

目的 对比2种结合方式的以白喉毒素无毒突变体197(cross-reacting material 197,CRM197)蛋白为载体制备的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗的质量与免疫原性。方法 方法一以CRM197蛋白羧基为结合位点,用1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate, CDAP)分别将A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基活化为氰基,以己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide, ADH)作为连接剂,最后通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐[4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl morpholinium chloride, DMTMM]与CRM197反应得到单价结合物;方法二用CRM197蛋白氨基为结合位点,用高碘酸钠分别氧化A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基为醛基,加入CRM197蛋白生成席夫碱,最后通过氰基硼氢化纳还原,得到单价结合物。对2种结合方式制备的结合物原液进行理化检测,合格后再分别将2种路线的单价结合物按比例与冻干辅料混合后经冻干制成2种ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗(ACYW135-CRM197),分别免疫NIH小鼠后,用ELISA检测小鼠血清中抗体并进行统计学分析。结果 2种结合方式制备的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗,游离多糖含量均<20.00%,K_D值在0.2以前的洗脱液多糖回收率均>80.00%,但以CRM197蛋白羧基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌单价结合物原液中游离多糖含量(3.20%~11.50%)均低于以氨基为结合位点的相应结合物原液中的游离多糖(8.35%~17.42%);疫苗成品的平均相对分子质量,以CRM197蛋白羧基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗更大。2种结合疫苗免疫小鼠后其体内产生的抗体经检定后统计分析,A群、C群多糖免疫原性差异均无统计学意义(P=0.080,P=0.176),W群、Y群多糖免疫原性差异均有统计学意义(P=0.015,P=0.027)。结论 以CRM197蛋白载体羧基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗在质量和免疫原性方面均不差于传统的以CRM197蛋白载体氨基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗。

3种不同载体蛋白C群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗在小鼠体内免疫原性的比较

目的比较白喉无毒突变体(cross-reactive material 197,CRM197)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)及破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)3种不同载体蛋白C群脑膜炎球菌荚膜多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)结合疫苗在小鼠体内的免疫原性。方法在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的缩合作用下,将TT和DT用1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)进行衍生,制备TTAH及DT-AH衍生物,GCMP再分别与TT-AH、DT-AH及CRM197共价结合制备结合物,经Sepharose 4FF凝胶柱分离纯化后,进行化学检测、相对分子质量测定及鉴别试验。用GCMP及3种结合物经皮下注射NIH小鼠,第0、14、28天各免疫1次,分别于首免后第7、21和35天经小鼠颈动脉采血,分离血清,ELISA法检测抗体效价。结果GCMP-TT和GCMP-DT的糖/蛋白比及多糖回收率较高,GCMP-CRM197较低,3种结合物游离多糖的含量均在5%以下,相对分子质量分别为5.8×10~6、2.8×10~6、1.1×10~6,且均可与GCMP的诊断血清产生沉淀线。3种结合物在小鼠体内均能产生良好的免疫原性,抗体水平均明显高于多糖组(P<0.05);免疫2针后,GCMP-TT与GCMPDT组的抗体水平差异无统计学意义(P>0.05),而GCMP-TT和GCMP-DT组的抗体水平明显高于GCMP-CRM197组(P<0.05);免疫3针后,GCMP-TT组小鼠产生抗体水平明显高于GCMP-DT及GCMP-CRM197组(P<0.05)。结论 3种不同载体的GCMP结合物免疫小鼠后均可产生良好的免疫应答,对于共价结合的方法,载体蛋白TT优于其他两种载体。

大肠杆菌表达CRM_(197)及其在通用流感疫苗中的应用

利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达白喉毒素无毒突变体CRM_(197),经变性条件下亲和纯化后,作为蛋白载体与流感抗原M2e经BMPH偶联,制备CRM_(197)-M2e结合物,用其免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法测定血清中M2e特异性IgG抗体.结果表明,重组CRM_(197)在大肠杆菌中成功表达,优化后蛋白表达量约为250±30 mg/L,纯度达95%以上;所制CRM_(197)-M2e结合物可有效免疫BALB/c小鼠,其刺激产生的M2e特异性IgG抗体滴度分别是健康组、M2e免疫对照组、CRM_(197)免疫对照组及CRM_(197)+M2e混合组的430.5,32,181和215倍.

脑膜炎球菌结合疫苗许可上市及美国免疫实施咨询委员会关于该疫苗的使用指南

2010年2月19日,美国食品药品管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准许可一种四价（A、C、W135、Y群）脑膜炎球菌结合疫苗（Meningococcal Conjugate Vaccine,MenACWY）-CRM[Cross Reacting Material（CRM）of Diphtheria Toxin，NOH—toxic Variant of Diphdleria Toxin——白喉毒素的无毒突变体]（Menveo，诺华疫苗和诊断公司上市。MenACWY—CRM是许可一剂注射，