羊泰勒虫与嗜吞噬细胞无浆体双重PCR检测方法的建立

为建立一种能快速对羊泰勒虫(ovine and caprine theileria)和嗜吞噬细胞无浆体(A.phagocytoph-ilum)同时进行检测的双重PCR方法。根据GenBank已报道的羊泰勒虫MPSP基因和羊嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因设计合成了2对特异性引物,通过条件优化,建立了双重PCR检测方法。双重PCR可特异扩增出羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体目的条带,片段大小分别为875bp和394bp。该方法具有较好的特异性,对羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的最低检出浓度为16fg/μL和1fg/μL。对采集的60份血液样本进行双重PCR检测,羊泰勒虫阳性率为46.67%(28/60),嗜吞噬细胞无浆体阳性率为13.33%(8/60),混合感染率为10%(6/60)。结果表明,双重PCR方法可用于羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的快速诊断和流行病学调查。

新疆一例牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染的病例初报

2021年8月17日,新疆托克逊县一头西门塔尔母牛出现高热、瘤胃胀气、肌肉震颤、呼吸急促、结膜黄染和血红蛋白尿等临床症状。为确认发病原因,采集该牛全血和体表蜱虫样品进行光学显微镜观察、血常规检测和聚合酶链式反应(PCR)检测。血涂片镜检结果显示,患牛疑似牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染;血常规检测显示,血红蛋白、血红细胞压积、平均血红蛋白浓度和中性粒细胞等指标下降,血小板和淋巴细胞百分比等指标上升,提示该牛机体存在贫血和炎症反应;血液样品PCR结果显示,牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体检测均呈阳性;蜱虫样品PCR结果显示,牛环形泰勒虫检测为阳性。综上,患牛最终被诊断为牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染。目前,此3种病原共同感染牛的案例极为少见。本研究为今后牛混合感染牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体的临床诊断提供了参考。

无浆体检测技术研究现状

无浆体是一种重要的蜱媒病原体,随着国内外学者对其关注度的提高,其对动物和人类健康的危害性也逐渐凸显,高效、准确的诊断技术显得尤其重要。实际工作中,多种分子生物学及血清学方法被用于无浆体的检测,检出率和准确性显著提高。论文综述了近5年无浆体的检测技术,对无浆体的感染诊断提供参考。

新疆阿克苏地区蜱和羊感染无浆体的分子流行病学调查

[目的]了解新疆阿克苏地区蜱与羊感染无浆体的情况。[方法]共采集192只蜱和477份羊抗凝血样品;以线粒体16S rDNA和ITS-2为靶基因,采用PCR法对经过形态学鉴定的蜱虫进行分子生物学鉴定;利用特异性引物,分别采用普通PCR法及巢式PCR法检测绵羊无浆体(Ananlasma ovis,A.ovis)和嗜吞噬细胞无浆体(Ananlasma phagocytophilum,A.phagocytophilum)在蜱和羊抗凝血样品中的携带情况;采用统计学方法分析不同种类、性别蜱虫和不同区域、不同饲养模式下羊感染上述2种无浆体的情况。[结果]采集到的192只蜱虫包括雄蜱79只、雌蜱113只,共有2属3种,分别为扇头蜱属的图兰扇头蜱(Rhipicephalus turanicus,R.turanicus)以及璃眼蜱属的亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticm,H.asiaticm)和小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicm,H.anatolicm),所占比例分别为52.60%、45.83%、1.56%。蜱样品中,感染2种无浆体的总体阳性率为7.29%,未检测到A.ovis和A.phagocytophilum混合感染;R.turanicus、H.asiaticm、H.anatolicm感染无浆体的阳性率分别为8.91%、5.68%、0,三者差异有统计学意义(χ^(2)=3.20,P<0.05);雄蜱和雌蜱感染无浆体的阳性率分别为6.33%、7.96%,二者差异无统计学意义(χ2=0.30,P>0.05)。羊抗凝血样品中,感染2种无浆体的总体阳性率为51.15%,与蜱样品的总体阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=111.35,P<0.05);A.ovis与A.phagocytophilum混合感染率为16.56%;舍饲羊和散养羊感染无浆体阳性率分别为28.16%和83.00%,二者差异有统计学意义(χ^(2)=139.81,P<0.05);库车市和沙雅县羊无浆体阳性率最低,为5.00%,温宿县阳性率最高,为64.83%,二者差异有统计学意义(χ^(2)=27.72,P<0.05)。[结论]阿克苏地区蜱和羊普遍感染无浆体,应该加强对无浆体病的防治工作。

一起绵羊无浆体病的诊断和防治

2022年8月,青海省贵德县常牧镇发生一起绵羊疫情,后诊断为绵羊无浆体病。本文详细介绍了该起绵羊无浆体病的诊断经过、用药情况及防治措施,建议加强蚊虫等体外寄生虫的驱虫工作,同时静注25%葡萄糖+维生素C注射液和灌服驱虫神鹰能够取得良好的治疗效果,这为绵羊无浆体病的防治提供参考。

吉林省部分地区蜱和羊携带羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体分子流行病学调查

为调查吉林省部分地区蜱虫和羊体内羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的流行情况,本试验采用PCR方法对采自吉林省5个地区的340份羊血液样本和841份蜱虫样本进行检测,并对部分阳性样本测序,建立系统发育树。结果显示,蜱虫中羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体阳性率分别为4.64%(39/841)和7.13%(60/841);羊血液样本中羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体阳性率分别17.06%(58/340)和10.00%(34/340),混合感染率为3.24%(11/340)。蜱虫和羊血液样本中感染的羊泰勒虫为吕氏泰勒虫单独感染,未检测到尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。系统发育树分析显示,蜱虫和羊血液样本中检测到的泰勒虫与吕氏泰勒虫处于同一分支,与吕氏泰勒虫河南株亲缘关系较近,与尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫亲缘关系较远;蜱虫和羊血液样本中检测到的嗜吞噬细胞无浆体与韩国株、俄罗斯株处于同一分支,亲缘关系较近。结果表明,吉林省羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体感染普遍存在。本调查结果为吉林省羊泰勒虫病和嗜吞噬细胞无浆体病的综合防治提供了理论依据。

人类无浆体病的病原学和流行病学研究进展

无浆体病是由无浆体属(Anaplasma)微生物引起的一类反刍动物慢性和急性传染病,其特征为高热、贫血、消瘦、黄疸和胆囊肿大。近年随着立克次体目微生物分类学的变化,原属埃立克体的马埃立克体、嗜吞噬细胞埃立克体和新近发现的引起人粒细胞埃立克体病(HGE)的病原体(HGE-A)三者被重新分类,成为无浆体属中的新种-嗜吞噬细胞无浆体。嗜吞噬细胞无浆体是一种人畜共患病病原体,对人、畜均有较强致病性,因此,人类嗜吞噬细胞无浆体病成为一种新的人类传染病。本文重点总结人类无浆体病的病原学和流行病学方面的一些研究进展。

新疆革蜱源性绵羊无浆体病原DNA检测

【目的】探究新疆部分地区羊体表寄生的优势革蜱携带病原状况。【方法】采用形态学(借助显微镜)和分子生物学(革蜱种属特异性ITS-2F、ITS-2R引物进行扩增)方法,对采集于阿勒泰、巴音郭楞州等地州羊体表寄生的蜱虫(N=267)进行种属鉴定,对其携带的绵羊无浆体病原(MSP4基因为靶标)DNA进行PCR检测。【结果】当地羊体表寄生的优势种革蜱为草原革蜱(D.nuttalli)、森林革蜱(D.slivarum)和边缘革蜱(D.marginatus),均能携带病原MSP4基因,且这三种革蜱种特异基因扩增产物序列(820 bp)与已登录记载的同种革蜱的核苷酸同源性为99%。被革蜱叮咬的126份羊全血样品中34份为绵羊无浆体阳性,均能扩增出850 bp目的基因条带。【结论】新疆阿勒泰地区、巴音郭楞州等地州羊群感染了绵羊无浆体病,其阳性率为27%(34/126)。为进一步研究新疆革蜱的公害州及羊无浆体病的综合防治提供科学依据。

基于绵羊无浆体Groel基因的PCR方法的建立

利用绵羊无浆体(Anaplasma ovis)高度保守的Groel基因,建立了快速、特异、敏感的绵羊无浆体检测方法。根据GenBank上登录的绵羊无浆体Groel基因序列(FJ460438),设计1对特异性引物,建立了绵羊无浆体PCR检测方法,并对其进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果显示,该方法能特异性地检测绵羊无浆体,与山羊无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、牛无浆体、边缘无浆体、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、羊附红细胞体、弓形虫基因组均无交叉反应;该方法检测下限可达到7.7×10-15 g·μL-1,比文献报道的PCR敏感10倍(77×10-15 g·μL-1);具有良好的重复性;对81份羊临床血液样品检测结果表明,绵羊无浆体感染率为32.1%(26/81),高于文献报道的PCR(MSP4基因)检测结果(18.5%,15/81)。

奶牛无浆体人工感染实验动物及其传播途径的研究

采用地塞米松注射液长期抑制试验动物的免疫力,通过小鼠腹腔、皮下接种含有无浆体病原的奶牛血液、阳性厩蝇内容物、脏器悬液,并进行阳性小鼠接触感染和兔子临床同层感染等试验,研究奶牛无浆体的感染和传播及在试验动物体内的消长规律,建立起无浆体人工感染模型,调查临床中病原体的实际传播途径。结果表明,无浆体在小鼠和兔子体内呈现一定的规律性。无浆体在感染后第6d和第8d分别在小鼠和兔子血液中可以检测到;感染后第16d～19d和第17d～20d在两者体内达到感染高峰;感染后第20d和第25d均逐渐消失。因此,可用小鼠或兔子在免疫抑制情况下建立无浆体人工感染动物模型。实验证明无浆体的感染方式有以下几种:腹腔、皮下接种、接触感染以及通过厩蝇等非蜱类吸血昆虫机械性传播。

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5(MSP5)基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因。将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析。结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。

我国部分地区奶山羊无浆体感染情况的调查

为了解我国奶山羊无浆体病的流行情况,应用套式PCR方法对2012年7月至2014年9月采自河南、云南、陕西共12个县区奶山羊的300份血样和204份奶样无浆体16SrRNA基因和MSP4基因进行检测,结果在血液样品中共检出3种无浆体,分别为嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum)、牛无浆体(A.bovis)和绵羊无浆体(A.ovis),阳性率分别为18%(54/300)、21.67%(65/300)、5.33%(16/300);血液无浆体总阳性率为23%(69/300);陕西奶山羊3种无浆体阳性率分别为A.phagocytophilum20.09%(47/234)、A.bovis 20.94%(49/234)、A.ovis 6.41%(15/234),河南分别为A.phagocytophilum11.11%(7/63)、A.bovis 25.4%(16/63),A.ovis 1.59%(1/63);云南均为0%(0/3)。仅在1份羊奶样品中检出A.ovis,阳性率为0.49%(1/204)。调查结果表明,奶山羊无浆体感染普遍存在;不同地区、不同品种、不同饲养方式奶山羊的无浆体阳性率及优势种存在差异;A.phagocytophilum作为人兽共患病原,在奶山羊养殖中应予高度重视。

奶牛无浆体病PCR诊断方法的建立及应用

利用边缘无浆体(Anaplasma marginale)高度保守的msp5基因,建立了奶牛无浆体病PCR诊断方法。特异性试验表明与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、温氏附红细胞体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和牛白细胞DNA无交叉反应;敏感性试验表明可检测到约200个感染红细胞。利用该方法对黑龙江省西部多个养牛场送检的140份血样进行检测,其中曾出现过高热、气喘、流涎和贫血等临床症状的"无名高热"奶牛血样95份、无临床症状奶牛血样45份,结果有上述临床症状奶牛PCR血样阳性率为44.2%,无症状奶牛血样PCR阳性率为13.3%。从而证实无浆体是引起奶牛"无名高热"的病原之一。

抗牛边缘无浆体MSP5单克隆抗体的制备

为制备抗牛边缘无浆体膜表面蛋白(MSP5)单克隆抗体(MAb),以原核表达的重组MSP5蛋白(rMSP5)免疫BALB/c鼠,应用常规杂交瘤技术获得2株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株(1D8和2F3)。间接ELISA检测腹水效价分别为5.49×105和7.83×104,亚类鉴定其重链为分别为IgG2b和lgG2a,轻链均为κ型;ELISA叠加试验表明这2株MAb识别的抗原位点相同或相近;Western blot结果显示2株MAb均能与rMSP5发生反应。特异性抗MSP5的MAb的获得,为牛边缘无浆体检测奠定了基础。

湖南地区边缘无浆体的MSP4基因的克隆及序列分析

本研究旨在阐明边缘无浆体(A.marginale)MSP4基因的遗传变异情况。应用PCR扩增A.marginale虫株的MSP4基因的部分序列(pMSP4),将其克隆至pGEM-T载体,重组质粒经菌落PCR鉴定及序列分析,结果表明来自湖南省的6株边缘pMSP4的序列长度均为530bp,与GenBank中登录的A.marginale相应序列相似性在98.3%以上,与其它无浆体的差异大于9.7%。由于A.marginale pMSP4序列种内相对保守,种间差异较大,因此,可作为种间遗传变异研究的标记。本研究为A.marginale的分子流行病学调查等提供了实验依据。

边缘无浆体的病原学与疫苗研究进展

对牛边缘无浆体分类学、形态学及增殖等方面的病原学特点进行了综述,并介绍了牛边缘无浆体疫苗发展方面的国内外进展情况。

边缘无浆体病诊断方法的研究进展

综述了边缘无浆体病的常规病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学检测方法的国内外研究现状和发展水平,并探讨了核酸探针、PCR和反向线状印迹杂交技术在边缘无浆体病诊断中的应用及研究进展。

PCR检测感染牛血液中边缘无浆体DNA

以边缘无浆体表面保护抗原的ｍｓｐｌβ基因设计和合成的１对２０ｍｅｒ寡核苷酸作为引物，用耐热的Ｔａｇ－ＤＮＡ聚合酶经５０个循环扩增边缘无浆体模板，扩增产物直接用凝胶电泳检测，并用标准分子量确定。结果表明，只有用边缘无浆体ＤＮＡ模板进行扩增时，扩增产物才能生成，而以血液原虫，如牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、锥虫和牛白细胞ＤＮＡ作模板扩增，无扩增产物生成。ＰＣＲ检测边缘无浆体的灵敏度可达约３００个无浆体的ＤＮＡ。

人工感染边缘无浆体对犊牛血清生化及血液流变学的影响

为通过人工感染的方法建立牛边缘无浆体病动物模型,研究边缘无浆体(A.marginale)感染对犊牛血液主要生化指标和血液流变学指标的影响,本实验采用地塞米松注射液长期抑制一月龄犊牛的免疫力,经颈静脉接种含有A.marginale的血液,定期采血,测定其血液主要生化指标和血液流变学指标。结果表明,感染A.marginale后,血液主要生化指标与对照组相比,谷丙转氨酶(GPT)含量极显著升高(p<0.01),谷草转氨酶(GOT)含量显著升高(p<0.05),血糖(GLU)含量显著降低(p<0.05),总胆固醇(T-CHO)含量极显著降低(p<0.01),而碱性磷酸酶(ALP)、血铁(Fe)、尿素(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBD)和肌苷(Cr)含量均无显著性变化;血液流变学主要指标与对照组相比,全血还原高切比粘度和红细胞刚性指数(IR)极显著降低(p<0.01),全血中切比粘度、全血低切比粘度和全血还原低切比粘度显著降低(p<0.05),全血高切比粘度、血浆比黏度(ηp)、红细胞压积(PCV)和红细胞聚集指数(AI)均无显著性变化。

边缘无浆体MSP5重组抗原间接ELISA检测方法的建立

将边缘无浆体MSP5基因在大肠杆菌DH5α中表达,获得45 ku的融合蛋白。Western-blot检测证实该表达蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原,建立了边缘无浆体MSP5的间接ELISA检测方法。该方法对边缘无浆体阴性、阳性血清(各100份)的阳性检出率和阴性符合率分别为100%和98%,与双芽巴贝虫、大巴贝虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、衣原体、血吸虫和羊肝片吸虫的阳性血清无交叉反应,与羊无浆体阳性血清有交叉反应。结果表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性。