麦胚无细胞蛋白合成系统研究进展

小麦胚芽作为面粉加工过程中的副产物,具有很高的生物活性,其中包含许多蛋白质合成必需的活性成分,如蛋白质合成场所、蛋白因子及其他相关酶系等。本文综述了在后基因组时代,随着生物技术的发展,以小麦胚芽为原料的无细胞蛋白合成系统在结构蛋白、毒性蛋白和功能蛋白表达方面的优势,阐述了其在蛋白质组学研究和生物制药等领域的重要应用潜力,以期小麦胚芽的深层次开发利用提供了重要依据。

高山被孢霉ω-3脂肪酸脱饱和酶基因在麦胚无细胞蛋白质合成系统中的表达

无细胞蛋白质合成系统具有快速、方便等特点,能表达对活细胞具有一定毒性的膜蛋白和抗菌肽,近年来被广泛应用。以来自产油丝状真菌高山被孢霉多不饱和脂肪酸合成途径中的关键膜结合酶——ω-3脂肪酸脱饱和酶为研究对象,构建了适宜体外表达ω-3脂肪酸脱饱和酶的表达载体p IVEX WG1.4-FADS15,并利用麦胚无细胞蛋白质合成系统实现了对该基因的高效表达。同时,通过在麦胚无细胞蛋白质合成过程中添加脂质体的方法,将所表达的膜蛋白正确定位至脂质体磷脂双分子层,以便目标蛋白质的正确折叠。研究结果显示,在此实验条件下目标蛋白质的表达量达1.8 mg/m L,经碘海醇密度梯度超速离心纯化后,该蛋白质的纯度可以达到90%以上。研究结果为后续对该酶进行催化特性研究和蛋白质晶体结构解析奠定了基础。

Vif基因体外表达载体构建及其在无细胞系统中的表达

随着-omics(组学)时代的到来,无细胞蛋白质合成系统以具有快速、方便、易于高通量等优点,正在被广泛地研究和应用。本文选取HIV病毒感染因子Vif作为目标蛋白,构建了适宜体外表达的Vif表达载体pIVEX2.4c-Vif,并将其在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中进行表达,为下一步进行高通量药物筛选奠定了一定的基础。

人造细胞内蛋白质合成的研究进展

无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis,CFPS)是一种在体外快速合成目标蛋白质的方法,通过构建含有CFPS系统的人造细胞,能够实现蛋白质的高通量表达和功能性膜蛋白的体外重构.本文详细综述了4种CFPS系统(包括大肠杆菌裂解液、兔网织红细胞裂解液、小麦胚芽提取物、酵母提取物)的适用范围和优缺点,总结了基于CFPS系统构建的人造细胞体系内蛋白质合成的研究现状,以及该领域面临的挑战及未来的发展方向.

膜蛋白的表达:在无细胞体系中实现功能性表达、折叠和组装

膜蛋白在人类和其他物种的生命活动中都起着至关重要的作用.在已完成测序的基因组中,膜蛋白占据30%.药物作用靶向位点、细胞之间的信号传递以及对外界环境的探测等功能,大多是通过生物膜上的特殊膜受体蛋白实现的.膜蛋白研究在工业、环境、国防、医学等领域具有重大意义.嗅觉受体蛋白是一类典型的膜蛋白,属于G蛋白偶联受体家族.嗅觉受体蛋白调控着生物的食物寻找、危险趋避和求偶行为.其主要分布于脊椎动物鼻腔和昆虫触角.嗅觉受体蛋白可以直接识别气味分子,将生物信号转化为电信号,最终传递至神经中枢,进而做出相关应答.膜蛋白的获取并不容易.天然组织中的膜蛋白含量太低不足以支撑学术研究.异源表达难以实现膜蛋白整合上膜,这给膜蛋白的结构和功能研究带来很大挑战.无细胞蛋白质合成系统是一个开放体系,且不依赖细胞活性,是体外表达蛋白质的有效方法.通过无细胞蛋白合成体系,在体外实现膜蛋白二聚体的自组装,将为膜蛋白研究带来全新突破.本文总结了用于无细胞表达的膜蛋白研究进展.

无细胞蛋白合成系统的研究进展

无细胞蛋白合成系统能够以 DNA或 RNA为模板直接在体外合成蛋白 ,通过种种技术改进 ,在某些个例中 ,蛋白表达量已接近体内表达水平 ,并且建立了翻译后修饰和蛋白纯化的方法 ,进一步提高无细胞系统的合成能力 。

无细胞蛋白质合成系统的研究进展及应用前景

无细胞蛋白质合成系统是现代迅速发展的蛋白质表达系统,以细胞抽提物中酶和蛋白质因子等作为基本反应体系,添加外源模板、底物以及能源物质等维持体系运作,最终在体外合成目标蛋白质。无细胞蛋白质合成系统突破了细胞的生理限制,能够灵活地进行蛋白质合成,极大地提高了蛋白质的产量,不仅可以作为研究转录和翻译的研究工具,而且可以实现蛋白质的高通量表达,在诸多领域带来了突破性的进展。现主要针对无细胞蛋白质合成系统的能量供给、蛋白质的稳定性和折叠修饰以及应用进行综述,以期推动对该技术的理解和应用。

基于无细胞蛋白合成系统体外合成芋螺毒素μ-PⅢA

目的利用大肠杆菌无细胞蛋白合成系统(CFPS)体外合成芋螺毒素Mu-conotoxin PⅢA(μ-PⅢA)。方法通过PCR扩增芋螺毒素μ-PⅢA肽前体3种肽段(信号肽、前体肽与成熟肽)不同组合的DNA片段,将其分别克隆到pIVEX-2.4d载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定后得到阳性克隆。在大肠杆菌CFPS体系中加入芋螺毒素μ-PⅢA体外合成所需反应液以及重组表达质粒并开始反应。最后用Western印迹对合成的芋螺毒素μ-PⅢA进行鉴定。结果双酶切和基因测序表明,pI-p3a1、pI-p3a2和pI-p3a3原核表达质粒均构建成功,Western印迹结果表明,通过CFPS体外合成出芋螺毒素μ-PⅢA。结论应用CFPS实现了芋螺毒素μ-PⅢA的可溶性表达,为芋螺毒素翻译后修饰机制研究奠定了实验基础。

激素和活性多肽

962161 用一种无细胞系统合成生物学活性的人神经生长因子和脑衍生的神经营养因子[英]/Takeshita,T.//J.Ferment. Bioeng.-1996,81(1).

植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶.以拟南芥生态型“Columbia gll”及甘蓝型油菜三系“陕2A”,“陕2B”和“垦C1”的叶片为材料,采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因.同源性搜索发现,来源于油菜的克隆基因是新基因.将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点,构建表达重组体,均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白.亚基0,亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统,体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力.不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明,NAD-IDH由3种亚基组成,缺一不可,缺少亚基0是致命的,缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的.同时发现,来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象,从而发生移框突变或无义突变,使突变亚基不表现正常亚基1功能,导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.